PKCβ1和MEK1/2在子宮內膜異位癥組織及間質細胞中的表達及意義

商麗紅，楊玉娥，王 芳，王文霞，哈春芳

子宮內膜異位癥(EMs)是育齡期婦女常見的激素依賴性疾病，引起子宮內膜異位癥的原因目前尚不清楚，月經血回流被認為是最有可能引起子宮內膜異位癥的原因，其他原因包括遺傳因素、免疫紊亂、雌激素失衡和手術等[1]。蛋白激酶Cβ1(Protein Kinase Cβ1，PKCβ1)是蛋白激酶家族中的一員，腫瘤學研究顯示，PKCβ1參與了多種癌癥的發生發展，并在細胞的增殖、侵襲、黏附等方面發揮重要作用[2]。絲裂原激活的蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)是MAPK信號通路的關鍵組成部分，該信號轉導途徑將細胞外信號傳遞到細胞核中，級聯激活多種蛋白，包括Ras、Raf、MEK和ERK。作為MAPK/ERK信號中至關重要的蛋白，MEK1/2被其上游RAF激酶磷酸化并激活。因此，MEK1/2的激活導致MAPK信號通路與多樣化的細胞過程有關，包括細胞增殖、分化、細胞存活和細胞凋亡[3]。本研究通過檢測PKCβ1、MEK1/2在子宮內膜組織和原代子宮內膜間質細胞中的表達情況，分析兩者與增殖侵襲相關蛋白的關系，進一步驗證其在子宮內膜異位癥中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本獲?。菏占?019年5月-2020年9月因卵巢子宮內膜異位癥行腹腔鏡手術，于術后或術后經病理科證實為Ems的患者60例，EMs在位內膜組與EMs異位內膜組各30例，同期因良性卵巢腫瘤行手術治療的患者30例作為對照組(正常子宮內膜組)。本研究已經通過醫學倫理委員會批準，患者均簽署治療知情同意書。

1.1.2 納入標準：研究對象年齡25～35歲，手術前患者月經周期正常，近3個月均未接受過激素類藥物治療，無生殖道炎癥及其他婦科疾病等。

1.2 主要試劑：PKCβ1抗體、MEK1/2抗體、MMP9抗體、PCNA抗體、DAB顯色試劑盒、蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化法:組織標本由病理科證實為EMs后于10%甲醛溶液中浸泡過夜，4%甲醛固定，脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚度連續切片，在70 ℃烤箱過夜;經過脫蠟，抗原修復，一抗孵育(PKCβ1、MEK1/2，4 ℃過夜)，二抗孵育2 h，DAB顯色，酒精梯度脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片，以PBS作為陰性對照，應用Image pro plus進行數據處理。

1.3.2 原代子宮內膜間質細胞培養：組織于手術時用刮勺刮取內膜，置于15 mL離心管中(含有配置好的培養基)，再置于冰盒中迅速送往實驗室。用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗子宮內膜組織中的血液成分，用眼科剪將內膜剪成約1 mm3大小的組織塊，加入膠原酶Ⅳ在37 ℃溫箱中吹打消化2次，每次10 min，吸取上清液加入離心管，1∶1的比例加入含有血清的培養液終止消化，800 r/min離心，取上清加入60 mm培養皿中，顯微鏡下觀察后置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

1.3.3 Western-blot檢測各組蛋白表達情況：按照凱基全蛋白質提取試劑盒提取細胞總蛋白，于酶標儀中進行蛋白定量，并置于沸水中煮5～10 min至蛋白變性，室溫冷卻后，-80 ℃冰箱保存備用。配置10%SDS分離膠及5%濃縮膠，插入相應大小的梳子，加入蛋白樣品及蛋白marker進行電泳及轉膜，載有蛋白的PVDF膜經5%脫脂牛奶封閉90min后，加入PKCβ1、MEK1/2，MMP9，PCNA，β-actin一抗4℃過夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，后加二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，增強型ECL工作液顯影，于BIO-RAD成像中曝光成像，計算相應的光密度比值。

2 結果

2.1 PKCβ1、MEK1/2在正常、EMs在位、EMs異位內膜中的表達：PKCβ1、MEK1/2在間質細胞和腺上皮細胞中均有表達，見圖1-圖6(封三)。EMs在位內膜組、異位組中PKCβ1、MEK1/2的表達高于正常子宮內膜組，且異位內膜組的表達高于在位內膜組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 PKCβ1、MEK1/2在3組子宮內膜組織中的表達

2.2 PKCβ1、MEK1/2、MMP9、PCNA在子宮內膜異位癥組及正常對照組間質細胞中的表達：EMs在位內膜間質細胞中PKCβ1，MEK1/2的表達高于正常對照組間質細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。EMs在位內膜間質細胞中MMP9、PCNA的表達高于正常對照組間質細胞，差異有統計學意義(P<0.05)，提示EMs在位內膜間質細胞的侵襲和增殖性高于正常對照組間質細胞，見圖7(封三)。

2.3 Pearson相關性分析：子宮內膜異位癥間質細胞中PKCβ1和MEK1/2的表達呈正相關(r=0.84，P<0.05)，PKCβ1和MMP9的表達呈正相關(r=0.77，P<0.05)，PKCβ1和PCNA的表達呈正相關(r=0.81，P<0.05)。MEK1/2和MMP9的表達呈正相關(r=0.82，P<0.05)，MEK1/2和PCNA的表達呈正相關(r=0.70，P<0.05)，提示PKCβ1和MEK1/2與間質細胞的侵襲和增殖性相關。

3 討論

子宮內膜異位癥是育齡期婦女常見的雌激素依賴性疾病，其特征是子宮內膜樣組織腺體或間質出現在子宮腔以外的部位，常伴有瘢痕形成和粘連。但其病因和發病機制目前尚不清楚。

蛋白激酶C(Protein kinase C)由11個酯類依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族組成，它們影響多種細胞功能，包括增殖、分化和凋亡。PKC同工酶在多種癌癥中有表達變化，參與多種癌癥的發生發展[4]，PKCβ1參與了細胞分化增殖凋亡和血管生成等生物學過程。研究發現激活PKC信號通路可以促進子宮內膜的生長發育[5]。Meola[6]等通過基因芯片檢測發現PKCβ1在子宮內膜異位癥異位內膜組織中表達增高。本研究中PKCβ1在子宮內膜異位癥在位及異位內膜組織中的表達高于正常對照組，且異位內膜中的表達高于在位內膜，驗證了PKCβ1與子宮內膜異位癥的關系。進一步分離培養原代子宮內膜間質細胞，通過Western-blot檢測了間質細胞中PKCβ1的表達，結果表明子宮內膜異位癥間質細胞中PKCβ1的表達水平明顯高于正常對照組間質細胞，差異具有統計學意義。

MAPK信號通路通常由RAS、RAF、MEK、ERK組成，引發涉及MEK的級聯反應，進而激活ERK，在調節真核細胞的基因表達中起重要作用，該信號通路控制著細胞生長、增殖、分化和遷移等細胞過程[7]。MAPK參與多種腫瘤的發生發展，在卵巢癌[8]中MAPK被異常激活，誘導腫瘤細胞的異常增殖、侵襲和黏附。多項研究表明，MAPK在子宮內膜異位癥中被激活，參與調節子宮內膜異位癥的發病機制，子宮內膜異位癥患者的異位子宮內膜細胞的增殖和存活與MAPK信號通路的異常激活有關[9]。在子宮內膜異位癥中MAPK信號通路在細胞增殖、凋亡和遷移的調節中起著重要作用，可能通過增強子宮內膜異位間質細胞在體外纖維化微環境中的增殖和存活來支持子宮內膜異位病變的生長[10]。因此MAPK信號通路的組成性激活參與多種癌癥的發生，而MEK1/2是MAPK信號級聯反應的重要組成部分，在MAPK級聯反應中起著至關重要的作用[11]，主要功能是參與細胞生長、增殖和分化。在本研究中發現MEK1/2在子宮內膜異位癥在位及異位內膜組織中的表達高于正常對照組，且異位內膜中的表達高于在位內膜，子宮內膜異位癥間質細胞中MEK1/2的表達水平明顯高于正常對照組間質細胞。

基質金屬蛋白酶9(MMP9)是介導細胞侵襲的關鍵酶，子宮內膜組織和外周血中MMP9水平的改變是EMs發生的重要危險因素[12]。研究發現MMP9在EMs始終高表達[13]，與沒有子宮內膜異位癥的婦女子宮內膜相比，MMP9的含量更高，具有更強的侵襲性[14]。多項研究已經檢測到與健康對照組相比，子宮內膜異位癥婦女腹水、血液、血漿、腹腔液、血清和尿液中MMP9蛋白水平顯著升高[15]。增殖細胞核抗原(PCNA)是細胞核中的一種酸性蛋白，是合成所必需的輔酶，PCNA水平代表細胞的增殖活性。本研究也發現MMP9、PCNA在子宮內膜異位癥間質細胞中存在高表達，相關性分析發現MMP9、PCNA與PKCβ1，MEK1/2存在正相關關系，但其具體的調節機制還有待進一步研究。