卵巢型子宮內膜異位癥患者血清及內膜中IKBa的表達及其臨床意義

白 雪，馬少寒，靳 雁，蘇育欣 ,祖逸崢，哈春芳

子宮內膜異位癥(EMs)簡稱內異癥，指具有活性的子宮內膜腺體和間質出現在宮腔以外的具有雌激素依賴性的婦科常見病。主要臨床表現有慢性盆腔痛、痛經、月經異常、不孕、性交不適等[1]。異位內膜組織可侵犯到全身任何部位，最常見的侵犯部位是卵巢和宮骶韌帶。內異癥是良性疾病，但具有種植、轉移及侵襲等類似惡性腫瘤的復雜性疾病[2]。其具體機制仍未完全闡明?，F在以1927年Sampson提出的經血逆流學說廣為學者們接受。而許多學者們證明，70%～90%的育齡期婦女可發生經血逆流，但僅有10%～20%的育齡期婦女發生內異癥，故此學說無法解釋出現在盆腔以外的內異癥[3]。核轉錄因子NF-kB是一種重要的生物因子，在靜止狀態下，其與抑制蛋白結合在細胞質中不能發揮作用，當受到刺激后NF-kB與IkB解離后進入細胞核，調控編碼基因的表達。NF-kB 包括NF-kB 抑制蛋白 (IkB)、NF-kB 家族及 IkB 激酶 (IKK)。其中IKBa是IkB蛋白家族中最重要的成員之一。周敏等學者已證實miR-196a在內異癥內膜組織中呈高表達[4]。同時研究發現，IKBa作為miR-196a直接靶基因，在大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤中呈高表達，且促進癌細胞的增殖和遷移，而具有惡性腫瘤特征的內異癥[5]，那么作為miR-196a下游靶基因之一的IKBa是否在內異癥患者血清、組織中表達以及與臨床相關影響因素間的臨床意義值得探討。

本實驗采用ELISA及免疫組化法檢測IKBa在卵巢型內異癥患者血清、在位內膜組織及異位內膜組織中的表達情況及其差異性，進一步分析IKBa與其臨床分期、疼痛評分、卵巢囊腫直徑等臨床相關影響因素的臨床意義，并由此推測IKBa在EMs發生發展中的作用，旨在為術前評估提供診斷依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2019年11月-2021年2月因卵巢型內異癥于寧夏醫科大學總醫院行手術治療的患者56例作為研究組(異位內膜組織56份、在位內膜組織35份、血清31份)，平均年齡為(35.39±7.70)歲。全部病例均經組織病理學明確診斷，且術前3個月未行任何激素治療。選擇同期因其他婦科良性疾病于我院行手術治療患者的正常子宮內膜30例作為對照組(內膜組織30份、血清25份)。該實驗已獲得寧夏醫科大學倫理委員會的批準與授權，實驗參與者均已簽署知情同意書。

1.2 納入標準:臨床癥狀為痛經、慢性盆腔痛、性交困難、月經失調和繼發性不孕。體征為單側或雙側卵巢可觸及大小不等、邊界不清、活動欠佳、壓痛陽性的囊性包塊。輔助檢查：超聲檢查單側或雙側卵巢可見囊性占位，邊界不清，透聲差等影像學表現；腹腔鏡探查發現典型的卵巢型內異癥，且經組織病理學證實為子宮內膜異位癥；無內科重大疾病、惡性腫瘤及其他婦科器質性疾??；術前3月無任何激素治療史。

排除標準：排除腹腔鏡證實為腹膜型和其他部位的內異癥；3個月接受過激素藥物治療；患有子宮內膜息肉、子宮內膜非典型性增生、生殖道炎癥及其他婦科器質性疾病。

1.3 主要試劑：ELISA法主要試劑，人核因子kB抑制蛋白(IKBa)酶聯免疫試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司。免疫組化法主要試劑：兔二步法檢測試劑盒購自北京諾博萊德科技有限公司。

1.4 實驗方法：ELISA法：將試劑盒從冷藏室移至室溫等待平穩15～30 min，將血液標本從-80 ℃冷凍冰箱取出自然解凍；按說明將4 800 pg/ml標準品稀釋為濃度為2 400 pg/mL、1 200 pg/mL、600 pg/mL、300 pg/mL及150 pg/mL(稀釋5倍)；將酶標板設置一個不加任何試劑的空白對照孔，再分別設置標準孔和樣本孔各三個孔，每個標準孔加入50 μL不同濃度的標準品，每個樣本孔中先加入40 μL樣品稀釋液，后加入10 μL待測樣品；于37 ℃溫箱里溫育30 min；蒸餾水按比例將濃縮洗滌液稀釋；去封板膜、棄去孔內液體，加滿洗滌液30秒后再次棄去孔內液體，重復5次；除空白孔外的每孔加入50 μL酶標試；再次溫育、洗滌，后每孔中先加入50 μL顯色劑A、再加50 μL顯色劑B后避光顯色；每孔加入50 μL終止液，最后在450 nm波長下測每孔的吸光度(OD值)。

免疫組化法：將儲存在零下-80 ℃冷凍冰箱的組織取出，切取體積約1 cm3的組織塊3塊，將其固定在10%的甲醛溶液中24 h，然后取出制成石蠟標本塊，將石蠟塊切成厚度約為3 μm的切片；用二甲苯脫蠟后遞減酒精脫去二甲苯并水化；微波抗原修復后加入適量內源性過氧化物酶阻斷劑來消除內源性過氧化物酶；加入適量的3%牛血清白蛋白封閉液在室溫孵育40 min后再加入適當比例稀釋的一抗(稀釋濃度為1∶150)，溫箱孵育3 h后至室溫放置1 h加入適量的增強酶標山羊抗兔IgG聚合物；DAB顯色液顯色；蘇木素染液復染；濃度上升梯度乙醇脫水；凝膠封片；顯微鏡下觀察3～8 min。

1.5 結果判讀標準：用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值帶入方程式算出IKBa濃度，再乘以稀釋倍數(×5倍)，單位換算后計算出的濃度為最終實際濃度。免疫組化陽性結果以細胞質和(或)細胞核膜出現棕黃色或黃色顆粒表示陽性著色。陽性著色細胞一般符合下列要求：①陽性著色顆粒定位較好；②鏡下可以觀察到清晰的子宮內膜組織的內膜和腺體結構；③背景顏色清晰、無污染，且染色部位強于背景色，須由兩位經驗豐富的專業人員獨立閱片。每個切片在400倍高倍鏡下隨機取3個視野，然后用圖像分析軟件系統分析并測定陽性細胞的平均灰度值。

2 結果

2.1 兩組患者血清中IKBa的水平比較：酶聯免疫法檢測卵巢型內異癥患者血清中IKBa的表達水平明顯高于非內異癥患者血清中IKBa的表達水平(P<0.05)，見表1。

表1 卵巢型內異癥患者和非內異癥患者血清中IKBa的水平比較

2.2 兩組患者在位、異位內膜及正常子宮內膜組織中IKBa蛋白表達情況：免疫組織化學檢測結果顯示，IKBa在卵巢型子宮內膜異位癥在位、異位內膜及正常子宮內膜組織中均有不同程度的表達，且大部分均表達于子宮內膜組織腺上皮細胞的胞質，異位內膜和在位內膜組織還部分表達于間質(見圖1-圖3，封三)。且IKBa在卵巢型子宮內膜在位內膜、異位內膜組織中的表達明顯高于正常子宮內膜組織中的表達(P<0.05),見表2。

表2 卵巢型內異癥患者在位、異位內膜及正常子宮內膜組織中IKBa的表達比較

2.3 卵巢型內異癥患者血清中IKBa表達的特點：卵巢型內異癥患者血清中IKBa的表達在臨床分期、病灶分布、有無盆腔浸潤、浸潤深度、有無痛經間差異無統計學意義(P>0.05)，而在異位囊腫直徑大小≤5 cm和囊腫直徑大小>5 cm組間差異亦無統計學意義(P>0.05)，若增大樣本量，異位囊腫直徑大小≤5 cm和異位囊腫直徑大小>5 cm間差異有統計學意義的可能性較大，見表3。

表3 卵巢型內異癥患者血清中IKBa表達的臨床特點

2.4 卵巢型內異癥患者異位內膜組織中IKBa表達的臨床相關因素分析：在卵巢型子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中IKBa的表達與臨床分期、有無痛經、疼痛評分、有無觸痛結節、有無盆腔浸潤、浸潤深度、病灶單雙側分布及患者年齡均無明顯統計學差異(P>0.05)，但在卵巢異位囊腫直徑≤5 cm與囊腫直徑>5 cm組間及在有無子宮肌瘤等合并癥組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且在囊腫直徑≤5 cm和囊腫直徑>5 cm的卵巢型內異癥囊腫大小中呈正相關(r=0.293，P<0.05)，見表4。

表4 卵巢型內異癥患者異位內膜組織中IKBa表達的臨床相關因素

3 討論

子宮內膜異位癥(EMs)是一種危害育齡期婦女常見的良性疾病，慢性盆腔痛、繼發并進行性痛經、性交不適和不孕癥與之密切相關。具有活性的子宮內膜可出現在全身任何部位，最常侵犯的部位是卵巢。EMs是良性疾病，但具有侵襲、增殖和異位種植等類似惡性腫瘤的生物學行為。目前EMs發病機制不明，研究顯示遺傳因素、盆腔內環境、免疫炎癥反應、激素調節和氧化因子等多種因素參與了EMs的疾病機制形成[6]。目前EMs的診斷金標準仍是腹腔鏡檢查，后是經病理組織學確認[7]，但其是一種有創檢查。EMs的無創診斷有助于疾病的早期發現和治療，提高生活質量并降低疾病相關費用。因此，其被世界子宮內膜異位癥學會和世界子宮內膜異位癥研究基金會選為優先研究項目。影像學診斷及血清標記物(如CA125)對EMS的特異性及靈敏度有限。因此，研究子宮內膜異位癥診斷的無創，特異性生物標記物是目前亟待解決的難題。

細胞核轉錄因子KB(NF-kB)是一種廣泛存在于細胞中的蛋白質分子，具有許多生物學功能，如在炎癥反應、細胞分化、凋亡和增殖過程中起重要作用，且與腫瘤的發生、轉移、浸潤及細胞的凋亡密切相關。靜息狀態下，NF-kB與抑制蛋白IKB形成三聚體存在于細胞基質中，當受到細菌、病毒、腫瘤壞死因子等因子刺激時，三聚體復合物被激活，開始調控靶基因的轉錄，從而引起相關疾病的發生[8]。張名香[9]等通過免疫組化方法檢測卵巢良性上皮腫瘤、卵巢交界性上皮腫瘤和卵巢癌中NFKB蛋白的表達，發現在卵巢良性上皮性腫瘤、卵巢交界性上皮腫瘤和卵巢癌中NFKB的陽性表達率分別是33.3%、37.5%和65.0%。卵巢癌中NFKB/P65的陽性率顯著高于良性卵巢癌，此研究結果還顯示在卵巢癌組織中，P65核染色陽性與腫瘤的分化、是否淋巴轉移、臨床期別和腫瘤直徑的大小有著明顯的相關性。Carlos[10]等通過RT-PCR、免疫組化、Western Blot及ELISA法檢測子宮內膜異位患者在位內膜組織及正常子宮內膜組織RELA、IKB激酶(Chuk)、NFKBIA和白介素-6的表達及NFKB DNA結合情況，結果顯示在內異癥患者在位內膜組織中，NFKB通路中的經典激活途徑中的部分蛋白出現異常，降低了它的轉錄功能，從而影響NFKBIA和白介素-6的表達，這兩個基因與子宮內膜異位癥局部促炎和子宮內膜增殖過程相關。微小RNA(miRNA)是內源性的非編碼RNA，在人類許多疾病中通過促進mRNA降解或抑制mRNA蛋白翻譯來調節基因表達。迄今為止，已鑒定出幾種miRNA在子宮內膜異位癥的發病機理中具有重要作用，其中周敏[4]等學者運用miRN微陣列分析法篩選了66個失調的miRNA和357個失調的mRNA。發現miR-196a和P-MEK/P-ERK在異位子宮內膜組織中均顯著上調。Zhang等人[11]研究表明，miR-196a在宮頸癌組織、癌前病變CINII-III和細胞系中顯著上調。Yang[12]等人研究發現，miR-196a可能通過調控下游靶基因HOXA10來促進上皮源性卵巢癌細胞的遷移和侵襲。作為miR-196a直接靶基因之一的IKBa，在大腸癌、胰腺癌、多形性膠質母細胞瘤等多種腫瘤中呈高表達，且能夠促進癌細胞的增殖和遷移，而具有惡性腫瘤侵襲與轉移特點的子宮內膜異位癥，推測IKBa作為miR-196a下游靶基因可能與子宮內膜異位癥的發生具有相關性。

本研究比較了卵巢型子宮內膜異位癥患者和非內異癥患者血清中IKBa的表達水平，及卵巢型子宮內膜異位癥和非內異癥患者在位、異位內膜及正常子宮內膜組織中IKBa的表達情況，結果顯示：IKBa在卵巢型子宮內膜異位癥患者血清、在位及異位內膜組織中的表達顯著高于非內異癥患者血清及正常子宮內膜組織，這提示IKBa的表達顯著差異性可能與卵巢型內異癥的形成有密切關聯。在分析臨床相關影響因素時發現，卵巢型子宮內膜異位癥患者血清及內膜組織中IKBa的表達與臨床分期、有無痛經、疼痛評分、有無觸痛結節、有無盆腔浸潤、浸潤深度、病灶單雙側分布及患者年齡均無明顯相關性(P>0.05)，而在卵巢型內異癥異位內膜組織中異位囊腫直徑≤5cm與囊腫直徑>5cm組間及在有無子宮肌瘤等合并癥組間比較有明顯差異，差異有統計學意義(P<0.05)，這表明卵巢型子宮內膜異位癥患者中卵巢異位囊腫直徑越大的患者IKBa的表達越高，且大多數合并子宮肌瘤、子宮腺肌癥等并發癥。這說明IKBa可能與卵巢型子宮內膜異位癥的形成和發展密切關聯。本實驗僅從IKBa蛋白水平研究其與卵巢型子宮內膜異位癥的關系，在一定范圍內得出了初步結論。IKBa作為miR-196a下游靶基因在卵巢型內異癥有了最初步的結論，兩者之間的關系及具體調控機制仍未知，后續可從基因與蛋白兩個水平，通過基因檢測技術來進一步驗證mi-196a與IKBa在卵巢子宮內膜異位癥中的具體調控機制，這也將成為本課題組將來研究的方向。

本研究探討了卵巢型子宮內膜異位患者血清中及在位、異位內膜組織中IKBa的具體表達情況及其臨床意義，為以后卵巢型子宮內膜異位癥的診斷、術前評估及診療方案提供了新思路。IKBa在卵巢型內異癥中的具體調控機制及能否作為判定卵巢型子宮內膜異位癥診斷生物學指標需要進一步探討與深入研究。