“黃芪-白術”藥對治療功能性便秘的網絡藥理學機制

翟孟凡 賈小強 王澤鵬 張嬌

摘要 目的：通過運用網絡藥理學方法來探究“黃芪-白術”治療功能性便秘（FC）的可能機制。方法：運用網絡數據庫對黃芪-白術藥對有效成分及FC靶點進行檢索篩選。運用作圖軟件構建“黃芪-白術”藥對的“成分-靶點”網絡圖。利用STRING數據庫構建黃芪-白術藥對治療便秘的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖，拓撲分析出核心靶點。最后，通過Metascape數據庫對藥物-疾病公共靶點進行生物過程及通路富集分析。結果：在黃芪-白術藥對中共篩選出27個與FC相關的有效成分和497個潛在作用靶點;拓撲分析得到16個核心靶點;富集分析得到20條富集結果，其中基因本體論（GO）生物過程的細胞對激素刺激的反應上靶點富集數目最多。結論：黃芪-白術藥對治療FC具有多成分、多靶點、多途徑的特點，其機制可能主要通過對細胞對激素刺激反應的調控來實現，也提示該通路是未來研究黃芪-白術藥對治療FC機制的重要方向。

關鍵詞 網絡藥理學;黃芪-白術;藥對;功能性便秘;機制研究

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Astragalus membranaceus-Atractylodes macrocephala in the treatment of functional constipation（FC）by network pharmacology.Methods：The effective components and FC targets of Astragalus membranaceus and Atractylodes macrocephala drug pair were searched and screened by using network database.By using STRING database to construct protein interaction network（PPI）of Astragalus membranaceus-Atractylodes macrocephala drug pair for constipation treatment，the core targets were topologically analyzed.Finally，bioprocess and pathway enrichment analysis of drug-disease public targets was made through Metascape database.Results：A total of 27 FC-related active ingredients and 497 potential targets were screened out from the Astragalus-Atractylodes macrocephala drug pair.By topological analysis，16 core targets were obtained.A total of 20 enrichment results were obtained by enrichment analysis.Among them，GO（gene ontology，GO）biological process cells had the largest number of targets enriched in cellular response to hormone stimulus（cellular response to hormone stimulus）.Conclusion：Astragalus-Atractylodes macrocephala drug pair is multi-component，multi-target and multi-channel in the treatment of FC，and its mechanism may be mainly realized through the regulation of cell response to hormone stimulation.It also suggests that this pathway is an important direction for future research on the mechanism of Astragalus-Atractylodes Macrocephala drug in the treatment of FC.

Keywords Network pharmacology; Astragalus-Atractylodes Macrocephala; Drug pair; Functional Constipation; Mechanism research

中圖分類號：R242;R574文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.003

功能性便秘（Functional Constipation，FC）是便秘的常見類型，其臨床表現主要為排便費力，排便次數減少，排便不盡感等，其發病因素與排除明確的藥物性因素和腸道器質性因素等因素有關[1]。FC是一種臨床常見病，多發病，在女性和中老年人中發病率更高[2]。黃芪-白術藥對治療功能性便秘效果確切，并有廣泛運用，但其具體作用成分和作用靶點尚未見到相關報道。最近幾年，網絡藥理學為研究中藥藥效的具體作用機制提供了思路，因其具有以“疾病、基因、藥物、靶點”為基礎的特色[3]。我們擬通過網絡藥理學的方法篩選黃芪-白術有效成分，確定疾病作用靶點，為進一步分析其治療功能性便秘機制提供循證依據。

1 資料與方法

1.1 黃芪-白術有效成分挖掘 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫以“huangqi”“baizhu”為關鍵詞進行檢索;按口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18條件篩選中藥成分。

1.2 黃芪-白術有效成分靶點預測 在TCMSP數據庫中查詢黃芪、白術有效成分對應的靶點蛋白，并導入Unitprot數據庫查詢蛋白的基因名稱，同時進行基因名標準化處理。

1.3 FC疾病的靶點預測 分別在Drugbank數據庫（www.drugbank.ca/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、TTD數據庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）中，以關鍵詞“Functional constipation”進行檢索，收集功能性便秘相關的靶點基因，并查閱文獻進行補充遺漏靶點信息;然后導入Uniprot數據庫進行基因名標準化處理，并進行整理歸納。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖的構建與分析 先將黃芪、白術有效成分作用靶點進行去重，再與FC靶點組建“成分-疾病”靶點數據庫，取二者交集，組成“成分-疾病”映射文件，即尋找成分與疾病共有的靶點。利用交集出的共有靶點與化合物成分，通過STRING數據庫建立“黃芪、白術-便秘靶點”的PPI網絡。利用Cytoscape軟件對靶點蛋白互作網絡以連接度（Dregree=6.73）進行篩選，拓撲分析得到靶點核心網絡圖。

1.5 生物通路及富集分析 利用Metascape數據庫針對“藥物-疾病”公共靶點進行生物功能和通路的富集分析，根據富集結果對“黃芪-白術”治療便秘的機制進行預測。

2 結果

2.1 “黃芪-白術”的有效成分收集和篩選 通過運用TCMSP數據庫，以“黃芪”“白術”為關鍵詞進行成分搜索，共得到藥物有效成分144個，其中白術56個，黃芪88個;基于藥代動力學參數（ADME），按照口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18條件，進行有效性篩選，同時查閱文獻進行補充，共得到“黃芪-白術”有效成分27個，其中黃芪20個，白術7個。見表1。由結果得知“黃芪-白術”有效成分主要包含黃酮類、萜類、脂類等;其中具有良好的OB和DL值有：Isoflavanone（異黃烷酮）、Mairin（丁子香萜）、α-Amyrin（α-香樹精）、Hederagenin（常春藤皂苷元）等等。由此可以推測黃芪-白術藥對具有多成分的藥理特點。

2.2 “黃芪-白術”有效成分靶點預測與成分-靶點關系網絡圖的構建 利用TCMSP數據庫，將“黃芪-白術”27個有效成分在數據庫內進行檢索，獲取其有效成分的對應靶點，共496個。并將其導入Unitprot數據庫（http：//www.Unitprot.org/）進行基因名標準化處理，再通過Cytoscape3.7.2軟件構建“黃芪白術-有效成分-靶點”網絡圖。見圖1。該圖由162個節點組成，紅色菱形符號代表中藥名，藍色三角形符號代表有效成分，綠色“V”字形符號代表有效成分所對應的靶點，節點與節點之間的邊表示成分與靶點之間的相互作用關系，平均自由度6.45，最大自由度88，最小自由度1。

2.3 疾病靶點信息的收集 在Drugbank、TTD、GeneCards數據庫中以“Functional constipation”為關鍵詞進行數據搜索。以“Relevance score>7”進行篩選，共尋找到靶點基因463個。其中Drugbank 51個、TTD 12個、GeneCards 400個。將以上數據庫合并整理后并導入Uniprot數據庫進行基因標準化處理，再以Uniprot ID為標準，利用EXCEL表格的“刪除重復值”功能，對數據進行去重，最終篩選得到疾病靶點342個;通過Cytoscape3.7.2軟件構建FC“疾病-靶點”網絡圖。見圖2。

2.4 PPI網絡的構建

利用EXCEL表格篩選功能，將463個FC疾病靶點和496個藥物有效成分靶點進行合并，取二者交集，得到藥物成分和疾病的共有靶點122個。把這122個靶點導入STRING數據庫建立起“黃芪、白術-FC靶點”的PPI網絡圖，再將該結果以STV格式導出，導入Cytoscape3.7.2軟件中對該網絡進行拓撲分析，以大于平均Degree值6.73為篩選標準，得到16個核心節點。見表2。并構建核心靶點PPI網絡圖。見圖3。結果提示該16個靶點在整個網絡中占據重要地位，提示這些靶點可能是黃芪白術發揮藥效治療作用的關鍵所在。

2.5 生物通路及富集分析

通過Metascape數據庫，對藥物與疾病公共靶點進行生物功能和通路的富集分析，然后把122個公共靶點輸入到該數據庫中，篩選背景設定為“Human”進行富集分析，根據靶點富集在通路上的數目以降序原則對通路進行排序。見圖4。

圖4A、B中，顏色深淺表示不同富集程度，富集程度越高顏色越深。圖4C中不同顏色節點表示不同通路?？梢钥闯?，黃芪-白術治療FC的關鍵靶點主富集在細胞對激素刺激的反應生物過程上最多，其次是PID AR TF通道、細胞對有機環狀化合物的反應生物過程、神經活性配體-受體相互作用KEGG通路等。見圖4A。由富集結果可以推測，“黃芪-白術”治療FC具有多通路的特點，其參與機制眾多較為復雜，根據公共靶點的富集程度來看，GO生物過程中細胞對激素刺激的反應上靶點富集數目最多;預測治療FC的機制可能主要通過細胞對激素刺激的反應的調控來實現，也提示該通路是未來研究黃芪-白術藥對治療FC的重要方向。

3 討論

現代醫學認為FC病因病機復雜，發病原因多見心態，性別，年齡，飲食，遺傳，知識水平等因素，發病機制多表現為Cajal間質細胞減少，腸道內容物改變，排便動力學改變，腸神經系統改變等。FC不僅病因病機復雜，而且危害嚴重，治療困難。長期的FC很容易導致痔瘡、肛裂等肛腸疾病的發生，提高胃腸道腫瘤的發病率，加重高血壓、心臟病等慢性疾病的臨床癥狀，甚至誘發死亡[4]?，F代醫學在治療FC時主要以口服瀉藥治療為主，近期通便效果好，但遠期效果欠佳，不僅無法治愈便秘，還可能導致結腸黑變病等不良反應。

古代醫籍對功能性便秘的記載有“大便難”“不大便”“大便秘”等，直至清代才正式確定“便秘”之名，并沿用至今[5]。中醫學認為便秘的發生與多臟腑密切相關，但其主要病位在大腸，可因脾虛失運、胃熱熾盛、肺熱下移等導致腸道傳導失司所致。中醫治療便秘以辨證論治口服中藥為主，臨床起效雖慢，但毒性及不良反應少，且具有多成分、多靶點等優勢。

王永炎[6]將便秘分為氣虛型、血虛型、陰虛型、陽虛型、冷秘、熱秘、氣秘7類，是現今最常用的便秘分型。其中氣虛型便秘主因肺脾氣虛引起，肺氣虛損，宣降失常，脾氣虛弱，無以運化，從而導致大腸無力傳導糟粕，形成便秘。黃芪歸脾經、肺經、有補氣升陽，益衛固表之功，白術歸脾經、胃經，有補氣健脾之功，二者均為補氣之要藥，同歸脾經，切中氣虛型便秘病機，二者常相須配伍使用治療氣虛型便秘[7]，如常見的黃芪白術通便湯[8]、補中益氣湯[9]、自擬升提固本湯[10]等。有數據挖掘表明，黃芪-白術藥對在功能性便秘的運用中高達120次[11]。

研究發現，黃芪的藥理作用有協調腸道環境，促進氧化代謝，增強腸道肌肉緊張度等;生白術的藥理作用有增加腸道肌肉緊張度和腸道動力等。此外，白術對腸道的作用還與白術的劑量和炮制方法有關[12]，低劑量的白術可以促進腸蠕動，而當劑量到達一定閾值以上，白術反而會抑制胃腸運動[13];生白術因揮發油含量高，可以促進腸蠕動，而炒白術因酯含量高，可以抑制腸蠕動[12]，所以在治療便秘時應選用小劑量生白術與黃芪配伍。腸道動力不只是FC發生的一個重要因素，黃芪、白術可通過增加腸道動力，改善腸道功能，從而達到治療FC的目的[14-15]。當黃芪-白術藥對治療FC時，其發揮作用的主要靶點是GSK-3β。GSK-3β是一種多功能的氨基酸激酶，當這種酶在腦中高度表達時，與多種神經系統疾病如阿爾茨海默病和雙相情感障礙的發生密切相關，而當這種酶在腦腸肽系統中高表達時，又可間接改變胃腸動力[16-17]。CALM3是黃芪-白術藥對治療FC的又一關鍵靶點，這個靶點其本質是一種蛋白質，因其能與鈣離子結合，故又稱之為鈣調蛋白。有研究表明，鈣調蛋白與腸道平滑肌收縮機制密切相關，當鈣調蛋白發生變化時，不僅會影響平滑肌正常收縮，還會導致腸道Cajal間質細胞（Imerstitial Cells of Cajal，ICC）自噬過度，從而引起胃腸動力障礙，導致FC的發生[18]。NOS2和NOS3屬于NOS的不同類型，其主要區別為NOS對鈣是否具有依賴性，當NOS對鈣具有依賴性時歸于NOS3，當NOS對鈣無依賴性時歸于NOS2。NOS與NO關系密切，是NO合成中唯一的酶。NO作為一種抑制性神經遞質，其在腸神經系統中表達時可以調控胃腸道動力，若NOS水平升高會通過影響NO的表達從而抑制胃腸道動力、影響胃腸道的運動導致FC的發生[19-20]。作為核受體超家族的一員，孕激素受體（Progesterone Receptor，PGR）與孕激素有密不可分的關系，PGR可通過影響孕激素從而導致FC的發生。研究表明，孕激素與1CC有一定關系，當人體孕激素增加時，發現腸道1CC數量減少，發生FC的概率升高[21]。

本研究結果顯示，黃芪-白術參與治療功能性便秘的主要活性物質是黃酮類、萜類、脂類等，其中具有良好OB和DL值的有異黃烷酮（Isoflavanone）、丁子香萜（Mairin）、α-香樹精（α-Amyrin）、常春藤皂苷元（Hederagenin）等。國內研究表明，黃酮類成分具有抗癌，抗氧化、促進代謝、抑制焦慮等作用[22]，萜類成分具有抗氧化、抗炎、保護心肌、保護神經等作用[23]，由此推測黃芪-白術可能從緩解神經焦慮情緒，增強機體代謝，促進腸道蠕動等方面治療FC。

黃芪-白術治療FC的關鍵核心靶點GSK3B，CALM3，NOS2，PGR，NOS3等則主要富集在細胞對激素刺激的反應、PID AR TF通道、細胞對有機環狀化合物的反應生物過程、神經活性配體-受體相互作用等通路上。神經活性配體-受體相互作用通路意義非凡，它集中了質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體[24]。GSK3B、CALM3、NOS2、PGR、NOS3等核心靶點可以歸為激素、有機環狀化合物和神經遞質等物質，通過對細胞的刺激和反應，從而調節Ca2+，NO，孕激素等，影響ICC數量和腦腸肽系統，達到治療FC的效果。

綜上所述，黃芪-白術藥對治療FC具有多成分、多靶點、多通路的特點，其機制可能主要通過對細胞對激素刺激反應的調控來實現，也提示該通路是未來研究黃芪-白術藥對治療FC機制的重要方向。利用網絡藥理學平臺對黃芪、白術成分靶點及FC疾病靶點進行預測，對臨床探究黃芪-白術藥對治療FC機制的研究具有重要意義。

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（2020-07-10收稿 責任編輯：楊覺雄）