單核細胞增生性李斯特菌化學發光免疫檢測法的建立及驗證

栗克文，魯倩茹，黃鳳玲，邢珂慧，邵佩蘭

1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.河南美凱生物科技有限公司，河南 漯河 462001

食品安全關系著國民身體健康，近年來，食品安全事件頻發，成為全世界共同關注的話題之一［1-3］。食品檢測作為保障食品安全的有效途徑，對于民生的保障發揮著巨大的作用。在食源性疾病中，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌及單核細胞增生性李斯特菌（簡稱單增李斯特菌）4種致病菌的常規檢測方法需進行增菌、分離、初篩及鑒定，耗時常達72 h以上［4］，同時，現階段的監測體系過于依賴儀器設備，操作復雜、耗時長，且設備價格昂貴，對于基層市場監管及食品流通的控制具有一定難度。因此，對于食源性病原菌而言，開發快速、高效、簡便的檢測方法具有較強的現實意義。

單增李斯特菌是一種不形成芽胞、不產生莢膜的革蘭陽性短桿菌，作為一種人畜共患病致病原，在污水、土壤、動物糞便等介質中廣泛存在。單增李斯特菌感染分為侵襲性及非侵襲性，侵襲性感染多感染妊娠期婦女，表現為流產、早產、甚至死產，胎兒則表現為新生兒敗血癥及新生兒腦膜炎，具有較高的死亡率。非侵襲性感染是由于該菌能在4℃環境繁殖，成為冰箱冷藏食品如冰激凌、蔬菜、水果、肉類等的主要致病菌，當大量誤食該菌污染的食品會引起感染，出現發熱、嘔吐、腹瀉、胃腸炎等癥狀，而這種類型感染易被人忽視。因此，WHO食品安全工作計劃將該菌作為重點檢測的食源性病原菌之一，我國食品安全風險監測網也將該菌列為常規監測的致病菌項目之一［5］，多個國家就致病菌限量標準進行了規定，其中熟肉制品及發酵肉制品中為不得檢出［6］。北京、河南、海南等多個地區進行李斯特菌調查發現，食品、刀具、砧板、冰箱等均存在不同程度的污染［7-13］。目前，單增李斯特菌的檢驗仍以培養方法為主，不能實現快速篩檢及批量樣本檢測。

本研究制備單增李斯特菌鼠源單抗及兔血清多抗，采用包被兔血清多抗-檢測單增李斯特菌-鼠源單抗-催化底物顯色雙抗體夾心反應體系，建立優化檢測單增李斯特菌的化學發光免疫法，以期為食品安全檢測提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及細胞 單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115、英諾克李斯特菌（Listeria innocua）ATCC33090購自上海復祥生物科技有限公司；單增李斯特菌CMCC54003及CMCC54004購自上海索寶生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922及沙門菌（Salmonella）ATCC-14028均購自河南美凱生物科技有限公司；SP／20骨髓瘤細胞購自鄭州恒德堂生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 普通級健康新西蘭大白兔［4只，雄性，體重（2.3±0.3）kg，6周齡］及清潔級BALB／c小鼠［8只，雌雄各半，體重（17±2）g，4周齡］購自河北省實驗動物中心，合格證編號：1709035。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM、RPMI1640及TSAYE平板培養基均購自美國Gibco公司；角鯊烯、斯盤85、吐溫-80、PEG-6000、魯米諾及牛血清白蛋白（BSA）均購自美國Sigma公司；羊抗鼠抗體-HRP購自北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光板購自深圳金燦華實業有限公司；Simplicity型超純水發生器購自美國密理博公司；Smartline型化學發光儀購自德國拜耳托德公司；MS3 Digital型混勻器購自德國艾卡儀器公司。

1.4 抗體制備

1.4.1 免疫原制備 將單增李斯特菌ATCC19115接種至100 mL TSA-YE培養基中，37℃，150 r／min搖床培養24 h；將菌液裝入離心管，1 816×g離心20 min，棄上清，收集沉淀菌體。用無菌生理鹽水懸浮，1 816×g離心20 min，棄上清，以上操作重復2次，收集沉淀菌體，加入100 mL含0.35%甲醛的無菌生理鹽水，37℃滅活24 h，1 816×g離心20 min，棄上清，收集菌體。用50 mL無菌生理鹽水重懸菌體，采用麥氏比濁法計數，5 mL／管分裝，-20℃保存備用。使用前取1管免疫原用無菌生理鹽水稀釋至1×109CFU／mL，取5.0 mL稀釋菌液加入5.0 mL MF59佐劑［14-15］，充分混勻，制成免疫原，4℃保存備用。

1.4.2 兔血清多抗的制備 新西蘭大白兔4只，經背部5個注射點皮下注射免疫原，每點0.2 mL，1 mL／只。首免后每隔14 d加強免疫1次，每點0.1 mL，0.5 mL／只，共加強免疫3次。第2次加強免疫7 d后耳緣靜脈采血，分離血清，檢測抗體效價。選擇抗體效價最高的1只白兔，于末次免疫第7天進行頸動脈取血，分離血清，采用飽和硫酸銨兩步法純化抗體，純化后按1∶1加入甘油，于-20℃保存。

1.4.3 鼠源單抗的制備 BALB／c小鼠8只，經脊柱兩側皮下免疫，免疫方法及周期同1.4.2項，初免劑量為0.2 mL／只，加強免疫劑量為0.1 mL／只。挑選抗體效價最高的小鼠，于末次免疫第3天進行脾細胞融合，單抗制備方法參考文獻［16-17］。將收集的腹水，用辛酸-硫酸銨方法進行純化，純化后按1∶1加入甘油，于-20℃保存。

1.5 方法的建立 將不同濃度兔血清多抗分別加入化學發光板進行包被，洗板，封閉后，依次加入1×105CFU／mL單增李斯特菌ATCC19115菌液50μL及鼠源單抗（1∶200稀釋）50μL，37℃反應不同時間；PBST洗滌5次，加入0.02 mol／mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）稀釋1 000倍的羊抗鼠抗體-HRP 100μL，37℃孵育60 min；PBST洗滌5次，加入含0.1 mg／mL魯米諾及0.01 mg／mL過氧化脲的磷酸鹽溶液（pH 8.0）100μL，室溫反應5 min；用化學發儀檢測化學發光強度值（RLU）。

1.6 方法的優化

1.6.1 包被抗體濃度的優化 將0.015 mol／L碳酸鹽緩沖液（pH 9.5）稀釋的1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.000 5 mg／mL兔血清多抗分別加入化學發光板，進行包被，其余操作按1.5項。

1.6.2 樣本反應時間的優化 用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學發光板，依次加入1×105CFU／mL單增李斯特菌ATCC19115菌液50μL及鼠源單抗（1∶200稀釋）50μL，于37℃分別孵育30、35、40、45、50、55、60 min，其余操作按1.5項。

1.7 方法的驗證

1.7.1 檢測范圍及靈敏度 用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學發光板，分別加入濃度為1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108CFU／mL單增李斯特菌50μL，其余操作按1.5項。

1.7.2 特異性 用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學發光板，分別加入1×104CFU／mL的單增李斯特菌ATCC19115、CMCC54003、CMCC54004、英諾克李斯特菌ATCC33090、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922及沙門菌ATCC14028各50μL，其余操作按1.5項。

1.7.3 準確性 在無菌環境下，將切碎的火腿腸及冰激凌各10 g分別置研缽中，加入90 mL無菌生理鹽水研磨成漿，4 650×g離心5 min，收集上清液；10 mL牛奶加入90 mL無菌生理鹽水充分混勻，4 650×g離心5 min，收集上清液。分別取3種樣本上清液各0.9 mL，加入1×105CFU／mL單增李斯特菌菌懸液0.1 mL，作為載體添加溶液；取生理鹽水0.9 mL，加入1×105CFU／mL單增李斯特菌菌懸液0.1 mL，作為陽性對照，同時以生理鹽水為陰性對照，以無菌的火腿腸、牛奶、冰激凌提取液作為空白對照。用0.05 mg／mL兔血清多抗包被化學發光板，分別加入陽性及陰性對照及3種載體添加溶液及其空白對照各50μL，其余操作按1.5項。按下式計算不同介質中單增李斯特菌的回收率。

回收率（%）=樣本檢測值／陽性對照值×100%

1.7.4 穩定性 用0.1 mg／mL多抗包被化學發光板，用鋁箔袋封裝并熱封閉，37℃分別放置7、14、21、28 d后取出，分別加入1×104CFU／mL單增李斯特菌菌懸液50μL，其余操作按1.5項。

2 結果

2.1 抗體效價 兔血清多抗效價為1∶256 000，鼠源單抗效價為1∶128 000。

2.2 方法的優化

2.2.1 兔血清多抗包被濃度 結果顯示，隨著兔血清多抗包被濃度的增加，單增李斯特菌發光值也增高，當包被濃度＞0.1 mg／mL時，單增李斯特菌發光值增加減緩，見圖1。選擇兔血清多抗包被濃度為0.05 mg／mL。

圖1 抗體不同包被濃度對單增李斯特菌發光值的影響Fig.1 Effect of antibody concentration for coating on chemiluminescence value of L.monocytogenes

2.2.2 反應時間 結果顯示，反應30～40 min，單增李斯特菌發光值較低，反應40 min后進入平臺期，見圖2。根據時間最短操作最優的原則，選擇40 min為最適反應時間。

圖2 不同反應時間對單增李斯特菌發光值的影響Fig.2 Effect of reaction time on chemiluminescence value of L.monocytogenes

2.3 方法的驗證

2.3.1 檢測范圍及靈敏度 結果顯示，隨著單增李斯特菌濃度增加，其發光值逐漸增高，當單增李斯特菌數濃度為1×106CFU／mL時，其發光值增加緩慢，大于1×107CFU／mL時，發光值進入平臺期，見圖3。該方法檢測單增李斯特菌濃度范圍為1×101～1×107CFU／mL，靈敏度小于10 CFU／mL。

圖3 不同濃度單增李斯特菌對發光值的影響Fig.3 Effect of L.monocytogenes concentration on chemiluminescence value

2.3.2 特異性 結果顯示，除單增李斯特菌ATCC-19115外，單增李斯特菌CMCC54003、CMCC54004、英諾克李斯特菌也可檢測到，而金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及沙門菌檢測不到，見圖4。表明該方法除單增李斯特菌外，對英諾克李斯特菌有部分交叉反應，對其他菌無交叉反應。

圖4 不同菌株的發光值Fig.4 Chemiluminescence valuesof various bacterial strains

2.3.3 準確性 結果顯示，添加菌液的冰激凌、火腿腸、牛奶均檢出單增李斯特菌，回收率分別為96.3%、90.3%和101.6%，陰性及空白對照均未檢出，見圖5。

圖5 不同介質對單增李斯特菌發光值的影響Fig.5 Effect of media on chemiluminescence value of L.monocytogenes

2.3.4 穩定性 結果顯示，隨放置時間增加，單增李斯特菌發光值逐漸降低，14 d后降速較緩，28 d發光值為初始包被值的75.3%，見圖6。方法的穩定性良好。

圖6 不同保存時間對單增李斯特菌發光值的影響Fig.6 Effect of time for storage on chemiluminescence value of L.monocytogenes

3 討論

免疫學檢測方法具有良好的特異性及重復性，可同時對多個樣品進行檢測，實現檢測自動化，而單一免疫學檢測法穩定性較差?；瘜W發光免疫分析方法是將高特異性的免疫分析法與高靈敏度的化學發光分析法結合后形成的一種新的測定方法，該方法可提高檢測的靈敏度及特異性。

本研究以單增李斯特菌為抗原制備鼠源單抗和兔血清多抗，構建“兔血清多抗載體-單增李斯特菌-鼠源單抗”雙抗體夾心反應體系，采用魯米諾作為發光底物，建立檢測單增李斯特菌化學發光免疫法，通過優化抗體包被濃度、樣本反應時間，該方法的檢測范圍達1×101～1×107CFU／mL，較傳統免疫學方法有顯著優勢［18-19］；通對化學發光板的穩定試驗，為理論貨架期提供了依據；除單增李斯特菌外，對英諾克李斯特菌有部分交叉反應，對其他菌無交叉反應，關于同菌屬的英諾克李斯特菌，可結合分子生物學方法作進一步的種屬篩查。

本研究成功建立了檢測單增李斯特菌化學發光免疫法，該方法特異性高、操作簡單、反應時間短、可批量檢測，能滿足普通的食品單增李斯特菌的快速檢測要求［20-21］，為開展食品風險評估，進行風險預警，促進食品安全檢測提供參考依據。