熱炎寧合劑HPLC指紋圖譜研究

蘇永健 劉紅娜 杜鑫 張小華 張仙娟

(1.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043；2.陜西創新醫藥研究中試工程中心有限公司,陜西 西安 710043)

熱炎寧合劑由清華德人西安幸福制藥有限公司獨家生產，是《中國藥典》2015年版(一部)收錄品種。熱炎寧合劑由蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮4味藥組成。功能為清熱解毒，用于外感風熱、內郁化火所致的風熱感冒、發熱、咽喉腫痛、口苦咽干、咳嗽痰黃、尿黃便結、化膿性扁桃體炎、急性咽炎、急性支氣管炎、單純性肺炎見上述證候者[1]?，F代研究證明熱炎寧合劑在治療小兒急性上呼吸道感染及扁桃體發炎時療效顯著[2]。最新研究證明熱炎寧合劑能改善新型冠狀病毒肺炎患者臨床癥狀，促進胸部CT好轉，縮短患者發熱時間，提高核酸轉陰率[3]。

目前關于熱炎寧合劑質量控制研究的文獻報道較少，主要以虎杖、蒲公英、北敗醬、半枝蓮中化學成分含量檢測為主。據文獻報道：虎杖中主要含蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、香豆素類以及一些脂肪酸類化合物[4-5]，蒲公英中主要含黃酮類、多糖類、色素類、有機酸類物質[6-9]，北敗醬中主要含黃酮類化合物及酯類和烷烴類成分、三萜類、甾體類、內酯類和有機酸等[10-13]，半枝蓮中主要含黃酮類、二萜類、揮發油類及多糖等化學成分[14-15]。指紋圖譜技術是近年逐漸發展起來的一項質量控制技術，它具有信息量大，特征性強，能整體控制多種組分[16-17]。本實驗參照2015年版《中國藥典》(一部)及相關文獻[18-25]，建立了以蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮中化學成分為主要指標的HPLC指紋圖譜，通過共有峰歸屬和指認來控制熱炎寧合劑的質量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1260 infinityII型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AG285型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；L-500型離心機(長沙湘儀離心機有限公司)。

1.2試劑與試藥 虎杖苷(批號111575-201603，純度87.3%)，大黃素(批號110756-201512，純度98.7%)，木犀草素(批號111520-201605，純度99.6%)，咖啡酸(批號110885-201703，純度99.7%)，綠原酸(批號110753-201817，純度96.8%)均購于中國食品藥品檢定研究院；熱炎寧合劑(清華德人西安幸福制藥有限公司)；色譜乙腈、色譜甲醇(美國Fisher公司)；磷酸(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)；甲醇(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150mm×4.6mm，4μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯度洗脫程序(0-35min，10%-35%A，90%-65%B；35-40min，35%-85%A，65%-15%B；40-45min，85%-100%A，15%-0%B；45-50min，100%-10%A，0%-90%B；50-60min，10%-10%A，90%-90%B)；體積流量0.8 mL/min；檢測波長：305nm；柱溫30℃；進樣量10μL。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液制備 取大黃素對照品、虎杖苷對照品、木犀草素對照品、綠原酸對照品、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1mL含大黃素80μg、虎杖苷350μg、木犀草素60μg、綠原酸90μg、咖啡酸80μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液 量取熱炎寧合劑10mL于離心管中，離心(4000轉/min)5分鐘，精密量取2mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇90 mL，超聲30min，至室溫后再加甲醇至刻度，搖勻，用0.22μm濾膜濾過，取續濾液，即得。10批熱炎寧合劑為清華德人西安幸福制藥有限公司生產，樣品批號見表1

表1 樣品信息表

2.2.3陰性樣品溶液 參照2015年版《中國藥典》(一部)熱炎寧合劑提取制備方法，分別制備缺4味藥材的陰性樣品，按2.2.2項下方法制備，即得。

2.3方法學考察

2.3.1精密度考察 用批號為190318的樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下連續進樣6針，以大黃素為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<3%，相對保留時間RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩定性考察 用批號為190318的樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下于0、2、4、8、12、24h進樣，以大黃素為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<3%，相對保留時間RSD<1%，表明供試品溶液24h內穩定性良好。

2.3.3重復性試驗 用批號為190318的樣品，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，在2.1項色譜條件下進樣，以大黃素為參照峰，測得各共有峰相對峰面積RSD<3%，相對保留時間RSD<2%，表明該方法重現性良好。

2.4指紋圖譜建立

2.4.1共有峰標定 選取大黃素為參照峰，色譜圖中各色譜峰保留時間與參照峰(S)保留時間的比值為相對保留時間，通過相對保留時間值標定共有峰，其中13個峰為10批樣品共有，標定為共有峰，共有峰見圖1。

圖1 10批熱炎寧合劑樣品HPLC圖

2.4.2相似度評價 共有峰通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012年版)分析，中位數法建立對照指紋圖譜，結果見圖2。10批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.980以上，結果見表2。

圖2 對照指紋圖譜

表2 相似度分析結果

2.4.3專屬性考察 分別吸取4種陰性樣品溶液，在2.1項色譜條件下進樣，色譜圖見圖3。通過與陰性樣比較可以得出1號、2號、3號、5號峰歸屬北敗醬及蒲公英(北敗醬及蒲公英化學成分相似)，4號、6號、7號、10號、11、號12號、13號歸屬虎杖，8號峰歸屬半枝蓮，9號峰屬歸北敗醬。

S1:熱炎寧合劑 S2：虎杖陰性樣 S3：半枝蓮陰性樣 S4：蒲公英陰性樣 S5：北敗醬陰性樣

2.4.4共有峰指認 吸取2.2.1項對照品溶液及2.2.2供試品溶液，在2.1項色譜條件下進樣，色譜圖見圖4。通過對照品對共有峰進行指認：2號峰為綠原酸, 3號峰咖啡酸, 4號峰為虎杖苷，9號峰為木犀草素，13號峰為大黃素，共指認5個共有峰。

A對照品HPLC圖

3 討論

本試驗采用不同濃度乙醇及甲醇分別對樣品進行超聲處理，并對超聲時間等條件進行考察，結果發現用甲醇超聲處理30 min后，色譜基線更平穩，峰數量較多，因此本實驗采用甲醇超聲處理30 min進行樣品制備。本實驗用甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈0.4%磷酸分別做梯度洗脫考察，結果發現用乙腈-0.1%磷酸進行梯度洗脫，色譜基線平穩，各峰分離度較好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作為梯度洗脫流動相。本研究還對流速，檢測波長，柱溫等進行了考察，最后選定流速為0.8 mL/min；檢測波長：305nm；柱溫30℃。

《中國藥典》2015版一部中熱炎寧合劑質量標準中，只對虎杖進行了薄層鑒別，含量測定項也只針對虎杖中的大黃素及虎杖苷進行測定，對處方中蒲公英、北敗醬、半枝蓮沒有制定控制項目，不能全面控制熱炎寧合劑質量。本試驗通過對樣品處理方法，色譜條件的考察，通過10批樣品檢測建立對照指紋圖譜，確認13個共有峰，通過陰性樣品比對，將13個共有峰分別歸屬于4種藥材，本方法較全面反映了熱炎寧合劑中各種成分的分布和比例關系，對更好控制熱炎寧合劑質量發揮重要作用。