大蒜素衍生物烯丙基半胱氨酸殼寡糖亞微球的制備及其理化性質、體外釋藥特點和質量穩定性的考察

劉旭

(沈陽市紅十字會醫院，遼寧 沈陽 110013)

大蒜素衍生物烯丙基半胱氨酸(SAC)是一種含硫氨基酸，YEH等[1]認為SAC能抑制肝細胞中膽固醇的合成而具有降低血漿膽固醇的作用。體內和體外實驗表明SAC具有抗腫瘤的作用[2]。此外，SAC具有清除自由基和抗氧化的作用[3]。殼聚糖(chitosan，CS)由于具有良好的生物相容性、生物降解性廣泛用作藥物載體[4]，用于藥物的緩釋或控釋，促進藥物的吸收[5-6]，但其分子量大，只能溶解于酸性水溶液，在生理pH下無法溶解[7-8]。消化道內水解糖苷的殼聚糖酶[9]缺乏，也導致其在體內吸收困難。殼寡糖又名殼聚寡糖，學名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是殼聚糖經特殊的生物酶技術處理得到的全新產品，具有水溶性好、生物活性高、分子量低的特點,在一定程度上提高了其在生理條件下的溶解度[10-11]。殼寡糖因含有游離氨基，能結合氫離子帶正電荷，其氨基亦能與芳香醛或脂肪醛反應生成希夫堿，交聯產物不易溶解，溶脹小，性質穩定。殼寡糖具有生物粘附性，可完全吸收，生物相容性好，被多種酶類降解，降解產物安全無毒。烯丙基半胱氨酸由于極性較大，水溶性較大，在體內溶出快、吸收快、消除快，療效維持時間較短，須多次給藥維持體內有效血藥濃度。本文利用無不良反應的三聚磷酸鈉(TPP)對殼寡糖進行離子誘導凝膠化形成納米粒[12]。在室溫攪拌下，將TPP溶液滴加到殼寡糖水溶液中，通過帶負電的磷酸根離子與殼寡糖分子鏈上帶正電的質子化氨基發生分子內、間交聯凝膠化，可迅速生成納米粒。離子凝膠化法反應條件溫和，易于調控反應結果，具有較高的包封率并能很好保持藥物的生物活性[13]。

1 SAC殼寡糖亞微球的制備

1.1溶液的配置 將殼寡糖分散于蒸餾水溶液中，隔夜溶脹，5000 r/min離心除去不溶物質，配成10.0 mg/mL的殼寡糖貯備溶液。TPP溶于蒸餾水配成1.0 mg/mL的TPP貯備液溶液，分別經0.45 μm微孔濾膜濾過備用。

1.2亞微球制備過程 取2.5 mg/mL的殼寡糖溶液2 mL，置10 mL的西林瓶中。以1 mL注射器精密吸取適量體積的TPP含藥溶液。在高速磁力攪拌下，以一定速度用注射器緩慢加入殼寡糖溶液中，攪拌30 min，即得SAC殼寡糖亞微球溶液。

2SAC殼寡糖亞微球處方研究 選擇以殼寡糖(CS)濃度、SAC濃度、CS與TPP的質量比，反應溶液的pH值作為考察對象，以包封率和粒徑為考察指標，篩選合適的處方。

2.1CS與TPP質量比的影響 固定CS濃度為2.5mg·mL-1，TPP濃度增加，成球越來越容易，TPP濃度增加到一定程度即生成沉淀，殼寡糖與TPP交聯到一起形成較大直徑的顆粒。用硫酸鈉絡合法和用戊二醛共價交聯法制備殼寡糖亞微球(CS-SM)，均是在特定濃度范圍內，一定的質量比才生成亞微球[14-15]。

Fig.1 Influence of CS and TPP ratios on the EE(%)of CS-SM

Fig.2 Influence of CS and TPP ratios on the mean particle size(nm)of CS-SM

由結果可知，當CS∶TPP在5∶1至7∶1時，可以形成粒徑較小及包封率較高的殼寡糖亞微球，7∶1時包封率達到75%以上。包封率與CS與TPP的比值有顯著的相關性，在一定范圍內，隨著比值的增大而增大，達到一定值時包封率下降。粒徑隨著CS與TPP的比值減小而增大，當增大至一定程度時，會形成沉淀。根據溶液的粒徑分布情況以及包封率，確定CS∶TPP的質量比為7∶1。

2.2CS與TPP濃度的影響 CS濃度對亞微球的包封率與粒徑影響較大。固定CS和TPP二者的質量比為7∶1，改變CS和TPP的濃度，試驗中發現亞微球只在特定的CS和TPP濃度范圍內形成[16]。兩者濃度過低時，溶液呈清亮而無膠粒生成；兩者濃度過高時，會生成較大粒徑的聚集體，經放置后易沉淀。最終確定CS的濃度為2.5 mg·mL-1，此時包封率可達75%以上，粒徑為149 nm。

Fig.3 The effect of different concentration of CS on particle size(nm)of SPRC SM

Fig.4 The effect of different concentration of CS on EE(%)of SPRC SM

2.3pH值的影響 配制濃度為2.5 mg·mL-1的殼寡糖溶液，CS/TPP質量比為7∶1，反應結束后以10%乙酸或NaOH調節體系pH值為3.0，4.0，5.0，6.0，結果見圖5。隨著pH值的增大，粒徑略增加，使用蒸餾水作為溶劑即可得到較高的包封率，并達到較理想的粒徑范圍，所以選擇蒸餾水作為溶劑。

Fig.5 The influence of PH value on the EE(%)of CS-SM

2.4藥物濃度對包封率的影響 由于亞微球的形成是利用殼寡糖的游離氨基與TPP陰離子發生分子間或分子內交聯反應，所以當殼寡糖和TPP的用量一定時，包裹的藥物量是有限的。藥物的濃度考察結果見圖6，當藥物的投藥量較小時，具有較好的包封率，隨著投藥量增加，包封率下降，最終選定藥物濃度為2.5 mg·mL-1。

Fig.6 The effect of the concentration of SAC(mg?mL-1)on EE(%)of CS-SM

2.5攪拌速度的影響 TPP溶液在攪拌條件下緩慢滴加到殼寡糖溶液中，攪拌的目的是迅速分散滴加到殼寡糖溶液中的TPP，避免出現局部TPP濃度過高，與大量殼寡糖分子產生凝聚，導致亞微球粒徑過大。攪拌速度過快，容易使液體飛濺，造成藥液的損失，因此確定攪拌速度為500 r·min-1。

2.6溫度的影響 在制備殼寡糖亞微球的過程中，當溫度達到60 ℃以上時，溶液出現混濁現象，溫度越高，越不利于殼寡糖亞微球的形成，因此實驗應于室溫下進行。

3 殼寡糖亞微球的表征

3.1粒徑及粒度分布測定 根據優化得到的最優處方制備5份SAC亞微球樣品，水化后，采用激光粒度測定儀分別測定粒徑大小和分布情況，測得粒徑(149.00±15.1)nm。圖7表明水化后亞微球的粒徑分布情況。

Fig.7 Particle size distribution of SAC chitosan sub microspheres

3.2SAC殼寡糖亞微球ξ-電位的測定 測定結果表明，本研究制得的亞微球帶正電荷，測定值為31.5±0.23mV(mean±SD)，體系相對穩定。

Fig.8 Zeta potential of SAC Chitosan sub microspheres

3.3SAC亞微球的在不同pH下的體外釋放 分別考察pH1.2、pH5.5、pH7.4與蒸餾水中的釋放曲線。結果表明在酸性條件下藥物很快釋放，在堿性條件下藥物帶負電，與帶正電的殼寡糖產生較強烈的吸附作用，所以釋放較慢，在pH接近pI時，釋放較慢，24 h累積釋放度為60%。蒸餾水中亞微球表現出一定的緩釋效果，18 h的累積釋放達85 %。

Fig.9 Release Profiles of SAC from SAC chitosan sub microspheres in PBS(pH7.4)at 37℃.

3.4釋放曲線模型擬合 分別用零級、一級和Higuchi方程對釋放曲線進行擬合，SAC亞微球體外釋放模型擬合程度為Higuchi模型>First-order模型> Hixson-Crowell模型> Zero-order模型，所以殼寡糖亞微球釋放符合擴散與溶蝕相結合的機制，以擴散為主。亞微球外釋放近似于Higuchi模型，采用Ritger-peppas模型進一步分析。0.43

Tab.1 Models for drug release fitting and correlation coefficients of SAC liposomes

4 SAC殼寡糖亞微球的凍干

亞微球在儲存過程中存在物理化學穩定性的問題，聚結而發生沉降[17]。為了提高亞微球物理及化學穩定性，可以采用冷凍干燥技術，將亞微球制成凍干粉末。

4.1預凍溫度的考察 預凍溫度采用-55～-70℃，采用超低溫冰箱-70℃急凍。

4.2干燥時間的考察 對干燥時間進行考察，由結果可知，干燥時間16 h與24 h對試驗結果影響不大，為縮短試驗周期，最終確定以16 h作為總的干燥時間。

4.3凍干處方的篩選

4.3.1凍干保護劑的篩選 試驗研究了葡萄糖、甘露醇、右旋糖苷的保護效果。凍干保護劑的濃度分別為3%、5%、8%、10%，同時以不加凍干支持劑的外觀作為對照。以外觀、再分散性為評價指標，考察各種支持劑的保護作用。

4.3.1.1外觀 凍干品的外觀是評價產品質量的一個重要指標，可影響再分散性、放置穩定性、包封率等，考察結果見Tab.2。由試驗結果可知，在無凍干保護劑與葡糖糖作支持劑時外觀不飽滿，甘露醇、右旋糖酐均能形成較好外觀。

Tab.2 The appearance of formulations containing different cryoprotectants

4.3.1.2再分散性 樣品的再分散性是保證質量的重要考察項目，再分散性好的凍干產品具有好的流動性，試驗結果見Tab.3。

Tab.3 Reconstitution of the various cryoprotectant on the character of the freeze-dried product.

與未加保護劑的亞微球相比，葡萄糖作保護劑可達到較好復溶效果。葡萄糖作為保護劑，隨著濃度的增加再分散性提高。綜上選擇合用葡萄糖與甘露醇作為凍干保護劑。對用量進行考察，結果見表4，確定為3%的葡萄糖與3%的甘露醇。

Tab.4 Research on the dosage of conbined cryoprotectants

5 SAC殼寡糖亞微球初步穩定性考察

穩定性試驗的目的是考察藥物制劑在溫度、濕度、光線、空氣的影響下隨時間變化的規律，為藥品的生產、包裝、貯存、運輸條件提供科學依據。

實施影響因素試驗內容與結果，將自制SAC殼寡糖凍干產品置于60℃恒溫箱、光照強度4500±500Ix中，在相對濕度為75%，分別于第0、5、10天取樣，檢測外觀、含量、釋放度，結果見表5。

Tab.5 Stability of SAC chitosan sub microspheres exposed to high temperature

初步穩定性考察結果表明殼寡糖亞微球對高溫敏感，顏色變深。光照條件下，各項檢測指標均無明顯變化。本品對濕度敏感，應低溫干燥密閉保存。

6 討論

殼寡糖(CS)是天然多糖，無毒無刺激，組織相容性好。殼寡糖亞微球的作用特點[18]：①藥物緩釋和控釋作用；②增加藥物的吸收作用；③增加藥物靶向性和降低藥物的副作用；④提高藥物穩定性。殼寡糖亞微球已被證實能有效地增強藥物通過鼻腔和腸道粘膜上皮的吸收。殼寡糖是一種安全有效的吸收促進劑，能夠粘附于粘膜上皮，延長藥物與上皮組織的接觸時間，并且可以打開上皮細胞之間的緊密連接，促進藥物通過上皮組織轉運，從而提高藥物的生物利用度，細胞毒性遠低于分子量較大的殼聚糖[19]。

殼寡糖的粒徑、包封率與殼寡糖濃度、殼寡糖與TPP的質量比有關。在一定范圍內，隨著殼寡糖濃度的增大、殼寡糖與TPP質量比的降低，包封率與粒徑顯著提高，達到一定值時，包封率下降。由于形成了更多的分子間氫鍵，更多的分子交聯在一起，使顆粒粒徑變大，當兩者濃度增加到一定程度時，過大的膠粒變成了沉淀[20]。溫度也對亞微球的形成有一定的影響，溫度過高不利于亞微球的形成，在低溫狀態下較易形成亞微球。在較低pH下形成的亞微球粒徑較小，包封率也較低，本文選擇在中性pH下制備亞微球，可以以蒸餾水作為介質。殼寡糖在蒸餾水中荷正電，對于SAC有較高的包封率，所制得的亞微球在蒸餾水中可以緩慢釋藥18h，在堿性條件下可以緩釋24h以上，在酸性條件下釋放較快。

亞微球凍干品以葡萄糖和甘露醇作為凍干保護劑，可以得到較飽滿的外觀并且再分散性良好，凍干品復溶后，粒徑變化較小。與脂質體相比較，殼寡糖亞微球具有較高的包封率和載藥量，但其對釋放介質的pH較敏感，在較低pH值下釋放較快，如作為口服制劑，在胃內會產生一定的釋放加快現象。