柚皮苷中藥單體調節miR-216a基因對結直腸癌細胞增殖和凋亡的影響研究

李永慧 王倩林 賈笑強 劉明成 李永芳

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年我國結直腸癌發病率和死亡率呈上升趨勢，嚴重危害人們生命健康[1]。目前結直腸癌的治療方法是手術、放化療及靶向治療的綜合治療，患者預后有顯著改善，但對于存在局部復發或遠處轉移的晚期結直腸癌患者，預后仍然很差[2]。因此，尋找有效的結直腸癌治療方法尤為重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種單鏈小分子RNA，長度約19～22nt，在生物體基因組廣泛存在，通常在轉錄后水平調控基因表達，在細胞增殖、凋亡、腫瘤發生等過程中發揮重要作用[3,4]。miR-216a是miRNA家族成員，有研究顯示，結直腸癌中miR-216a表達降低，miR-216a-3p可直接靶向COX-2和ALOX5抑制結直腸癌細胞增殖[5]。柚皮苷是一種主要存在于葡萄柚、柚子、酸橙等果皮和果肉中的天然黃酮類化合物，有抗氧化應激、降血糖、抗炎、抗腫瘤等廣泛的生物學活性[6-8]。有研究顯示，柚皮苷對前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞生長有抑制作用[9,10]。結直腸癌中柚皮苷的研究較少，有研究顯示，在化療模型小鼠中，柚皮苷可降低結直腸癌癌前病變及結直腸癌重構[11]；柚皮苷可防治偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘發的小鼠慢性結直腸炎及癌變[12]。柚皮苷對人結直腸癌細胞生長影響及機制尚未明確。有研究顯示，柚皮苷可調控miR126/VCAM1抑制非小細胞肺癌生長[13]。因此，本研究旨在柚皮苷是否可調節miR-216a影響結直腸癌細胞增殖和凋亡，以期為結直腸癌治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 柚皮苷購自中國藥品生物制品檢定所；RPMI 1640培養基和青鏈霉素均購自美國Gibao公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液、ECL發光液及細胞凋亡試劑盒均購自中國碧云天；KIAA1199抗體購自美國Abcam公司；脂質體2000試劑均購自美國Invitrogen公司；MTT、DMSO均購自美國Sigma公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養 結直腸癌細胞系SW620、LOVO和HCT116及正常結腸上皮細胞NCM460均購自美國ATCC。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，置于5%體積分數CO2、37℃培養箱培養細胞。每天換液1次。細胞達80%～90%生長密度時進行傳代。實驗為生長至對數期的細胞。

1.3 qRT-PCR檢測結直腸癌細胞miR-216a和KIAA1199基因表達 按照總RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA在260/280吸光度值(OD)，將OD值在1.8～2.0的RNA逆轉錄為cDNA。依據引物設計原則設計miR-216a和KIAA1199引物，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，所有引物序列如下：miR-216a F 5’-ACACTCCAGCTGGGCATTATTACTTTTGG-3’，R 5’-TGGTGTCGTGGAGTJP2CG-3’；U6 F 5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，R 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；KIAA1199 F 5’-TGCCACGGTCTATTCCATC-3’，5’-TCCTTTACCAACCCCAATG-3’；GAPDH F 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，R 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；以cDNA產物為模板，參照qRT`-PCR試劑盒說明配置20 μl PCR反應體系及設置反應條件，設置5個復孔。反應結束后，根據所得Ct均值，以U6或GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-216a基因和KIAA1199基因的相對表達水平。實驗重復3次。

1.4 Western blotting檢測KIAA1199表達 細胞中加適量裂解液，4℃反應30 min后，離心，移液器吸取管內上清液，上清即為提取總蛋白。BCA法定量蛋白。按照1∶4比例將總蛋白及上樣緩沖液混勻，100℃沸水變性5 min。每孔40 μg變性蛋白，經SDS-PAGE電泳、電轉PVDF膜后，將轉移完成的膜置于TBST中漂洗1次，然后使用5 %的BSA封閉液在室溫條件下封閉膜2 h，TBST洗膜。加1∶1 000稀釋的KIAA1199抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜。加1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育2 h。膜含蛋白一側滴加ECL顯色液，放入成像儀內進行曝光處理，成像并保存圖片。Image J軟件分析灰度值，以GAPDH作為內參，得出KIAA1199的相關表達水平。

1.5 細胞轉染 以1×106個/孔接種SW620細胞于6孔板，每孔2 ml，24 h后細胞達60%～70%生長密度時即可進行轉染。轉染前2 h換液，在1.5 ml無菌管中配置A液：脂質體2 000與無血清及無雙抗的混合液，體積為250 μl；B液：miR-216a mimics及mimics對照(miR-NC)、miR-216a inhibitor及對照(anti-miR-NC)、KIAA1199過表達載體(KIAA1199組)及空載體(pcDNA3.1組)與脂質體2000混合液，體積為250 μl。將A液和B液在室溫條件下放置5 min，輕柔混勻，室溫放置20 min。將復合物加入6孔板中，繼續培養4～6 h，換成含血清的完全培養基，繼續培養，用于后續實驗研究。

1.6 MTT檢測細胞增殖 以5 000個/孔接種對數生長期的SW620細胞于96孔板，常規培養24 h后，使用0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L柚皮苷處理細胞，miR-216a mimics及miR-NC轉染細胞，每組設置5個平行孔。分別在處理的24 h、48 h和72 h收集細胞，每孔加5 mg/ml的MTT試劑20 μl，常規孵育4 h，吸去細胞培養液，每孔加150 μl DMSO，將細胞培養板放置于振蕩器上震蕩5 min。結晶溶解充分后，酶標儀測定490 nm波長下各組細胞光密度值(OD值)。實驗重復3次。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 收集使用0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷及miR-216a mimics處理48 h的SW620細胞，胰酶消化細胞，制備成單細胞懸液。預冷PBS洗滌細胞2次，加250 μl的binding buffer重懸細胞，并將細胞濃度調整為1×106/ml。取100 μl細胞懸液于流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC溶液，室溫避光靜置15 min，然后加10 μl PI溶液，室溫避光靜置5 min。細胞充分染色后，再加入300 μl的binding buffer溶液，1 h內通過流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗 在線生物信息學預測工具顯示，miR-216a的5’UTR與KIAA1199 的3’UTR有連續的結合位點。依據結合位點信息構建野生型KIAA1199 3’UTR報告載體(KIAA1199-WT)，其后以KIAA1199-WT為模板對其結合位點進行突變，得到突變型KIAA1199 3’UTR報告載體(KIAA1199-MUT)。將KIAA1199-WT及KIAA1199-MUT分別與miR-216a mimics共轉染至SW620細胞，轉染48 h，使用雙熒光素酶報告基因測定試劑盒檢測各組細胞的熒光素酶活力。實驗重復3次。

2 結果

2.1 不同結直腸癌細胞miR-216a基因和KIAA1199基因表達 以正常結腸上皮細胞NCM460為對照，qRT-PCR檢測三株結直腸癌細胞(SW620、LOVO和HCT116)miR-216a和KIAA1199基因mRNA表達，Western blotting檢測KIAA1199蛋白表達，與NCM460細胞miR-216a和KIAA1199表達比較，三株結直腸癌細胞miR-216a基因表達明顯降低，KIAA1199基因mRNA及蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。選擇SW620細胞作為研究對象。見圖1，表1。

圖1 Western blotting檢測結直腸癌細胞KIAA1199蛋白表達

表1 miR-216a和KIAA1199在結直腸癌細胞中的表達

2.2 miR-216a和KIAA1199靶向關系驗證 生物信息學軟件顯示miR-216a序列與KIAA1199 3’UTR區存在連續的結合位點。將構建的KIAA1199-WT質粒和KIAA1199-MUT質粒與miR-216a mimics共轉染至SW620細胞，進行雙熒光素酶報告基因實驗，miR-216a mimics與KIAA1199-WT共轉染較其余3組(miR-NC與KIAA1199-WT組、miR-NC與KIAA1199-MUT組、miR-216a mimics與KIAA1199-MUT組)熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，其余3組熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。提示miR-216a與KIAA1199存在靶向關系。進一步證實miR-216a對KIAA1199表達的影響，通過qRT-PCR將miR-216a mimics/inhibittor轉染SW620細胞后KIAA1199基因表達，轉染miR-216a mimics的SW620細胞KIAA1199基因mRNA及蛋白表達均明顯降低，轉染miR-216a inhibittor的SW620細胞KIAA1199基因mRNA及蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。說明miR-216a與KIAA1199存在靶向關系，miR-216a可負向調控KIAA1199的表達。見圖2，表2、3。

圖2 miR-216a與KIAA1199 3’UTR結合位點及轉染miR-216a mimics/inhibittor的SW620細胞KIAA1199蛋白表達

表2 雙熒光素酶報告基因檢測miR-216a和KIAA1199的靶向關系

表3 SW620細胞轉染miR-216a mimics/inhibittor后KIAA1199 mRNA及蛋白表達

2.3 miR-216a靶向KIAA1199基因對SW620細胞增殖凋亡的影響 將miR-216a mimics及miR-216a mimics和KIAA1199過表達載體轉染SW620細胞，細胞增殖及凋亡檢測結果，與miR-NC組比較，miR-216a組和miR-216a+pcDNA3.1組細胞活力明顯降低，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。miR-216a組和miR-216a+pcDNA3.1組細胞活力及凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。與miR-216a+pcDNA3.1組比較，miR-216a+KIAA1199組細胞活力明顯升高，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 miR-216a 靶向KIAA1199對SW620細胞凋亡的影響

表4 miR-216a 靶向KIAA1199對SW620細胞增殖、凋亡的影響

2.4 柚皮苷對SW620細胞增殖凋亡的影響 MTT結果顯示，0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷處理SW620細胞后，細胞活力明顯降低，呈現劑量和時間依賴性(P<0.05)。流式細胞術檢測結果顯示，0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷處理SW620細胞48 h，細胞凋亡率明顯升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 不同濃度柚皮苷對SW620細胞凋亡的影響

表5 不同濃度柚皮苷對SW620細胞增殖凋亡的影響

2.5 柚皮苷對miR-216a和KIAA1199基因表達的影響 qRT-PCR結果顯示，0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷處理SW620細胞48 h，miR-216a 基因mRNA表達明顯升高，KIAA1199基因mRNA表達及蛋白表達均明顯降低，呈劑量依賴性(P<0.05)。見表6，圖5。

表6 不同濃度柚皮苷對SW620細胞miR-216a和KIAA1199基因mRNA表達的影響

圖5 Western blotting檢測柚皮苷對SW620細胞KIAA1199蛋白表達的影響

3 討論

miRNA是一種小分子非編碼RNA，可通過與靶mRNA特異性結合，降解靶基因mRNA或抑制其靶蛋白合成，從而影響細胞增殖、凋亡、腫瘤發生等過程[14]。結直腸癌變、侵襲轉移、耐藥等多個方面，均與miRNA異常表達有關，miRNA參與了結直腸癌發生發展的全過程[15]。尋找影響結直腸癌發生發展的miRNA及相應的致癌或抑癌靶基因對于其診療具有重要意義。既往研究發現，miR-216a在胰腺癌、胃癌、腎癌等多種腫瘤細胞中異常表達，其異常表達可促進腫瘤進展[16-18]。本研究檢測了三株結直腸癌細胞(SW620、LOVO和HCT116)中miR-216a基因表達，發現SW620細胞中miR-216a表達最低，因此作為研究對象。過表達miR-216a可明顯抑制SW620細胞增殖，促進細胞凋亡。提示miR-216a與結直腸癌生長抑制有關。有研究顯示，miR-216a可通過調節KIAA1199/CEMIP抑制結直腸癌細胞侵襲和轉移[19]。KIAA1199是HUGA蛋白質數據庫中KIAA家族成員之一，近年來大量研究表明，KIAA1199可影響多種腫瘤細胞增殖、侵襲遷移、粘附等過程，與腫瘤發生發展密切相關。Xu等[20]研究顯示，KIAA1199高表達與結直腸癌侵襲、TNM分期及預后不良有關；Zhao等[21]研究顯示，KIAA1199可通過PP2A/stathmin促進結直腸癌細胞轉移。本研究使用靶基因預測軟件及雙熒光素酶報告基因實驗證實KIAA1199是miR-216a的靶基因，進一步通過miR-216a mimics/inhibitor證實KIAA1199受miR-216a的調控。將miR-216a mimics與KIAA1199過表達載體共轉染至SW620細胞，發現過表達KIAA1199可明顯減弱miR-216a mimics對SW620細胞增殖、凋亡的影響。提示miR-216a可靶向抑制KIAA1199降低結直腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡。

多項研究指出，柚皮苷有較強的抗癌作用，如Aroui等[22]研究顯示，柚皮苷可通過下調MMP-2、MMP-9的表達及p38信號通路抑制膠質母細胞瘤細胞的侵襲和遷移；Raha等[23]研究顯示，柚皮苷通過激活MAPK途徑及下調PI3K/Akt/mTOR途徑誘導自噬介導的胃癌 AGS細胞生長抑制。本研究首先檢測不同濃度柚皮苷對SW620細胞活力及凋亡的影響，發現柚皮苷可明顯抑制結直腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，這與在其他腫瘤中研究結果一致。通過qRT-PCR檢測柚皮苷對miR-216a和KIAA1199表達的影響，發現不同濃度柚皮苷均可上調miR-216a表達，下調KIAA1199表達。有研究顯示，柚皮苷可通過調節miR-19b促進肝癌細胞凋亡[24]。本研究結果提示柚皮苷可能通過調節miR-216a/KIAA1199影響結直腸癌細胞增殖和凋亡。

綜上所述，結直腸癌細胞miR-216a低表達，KIAA1199高表達，miR-216a可通過靶向抑制KIAA1199降低結直腸癌細胞增殖和促進細胞凋亡。柚皮苷可抑制結直腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，且可上調miR-216a表達和下調KIAA1199表達。提示柚皮苷可能通過引起miR-216a表達水平改變進而調控KIAA1199表達，從而影響結直腸癌細胞增殖和凋亡。本研究可能為柚皮苷在結直腸癌治療及研究中提供了理論基礎。