肺腺癌中TNF-α、SOD-2與增殖的關系研究

易力 劉宏雷 郝增方 賈欣

肺癌是全球最常見的癌癥，是目前死亡率最高的惡性腫瘤之一，并且是我國癌癥導致死亡的首要原因[1,2]。多項研究結果表明，煙草、石棉和真菌毒素等環境污染物可以促進肺癌的發生發展[3-6]。我課題組前期研究發現灌胃黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFG1)可以誘發小鼠肺部慢性炎癥，最終發生肺腺癌[7]。并發現在AFG1誘導的小鼠肺腺癌標本中，炎癥細胞因子TNF-α和IL-6、SOD-2和EMT及侵襲相關指標均高表達，而且已經通過體外實驗證明SOD-2介導了炎癥細胞因子TNF-α誘導的肺腺癌細胞EMT和遷移[8]。本文旨在揭示人肺腺癌手術標本中TNF-α-SOD2-肺腺癌增殖之間的關系及SOD-2和肺腺癌患者生存預后的關系，為臨床預測預后提供新的指標。

1 材料與方法

1.1 材料 選取河北醫科大學第二醫院病理科2009年1月至2014年12月診斷的肺腺癌石蠟標本共68例為肺腺癌組，術前未經過放療或化療。另取20例正常肺組織作為對照組。收集患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、分化程度及有無淋巴結轉移等，并進行電話隨訪完善生存時間。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學方法:所選標本蠟塊進行連續切片，厚度為 4 μm。免疫組化方法參照SP試劑盒(杭州四季青公司)，加一抗TNF-α(美國Cell Singaling公司)、SOD-2(美國Epitomics公司)、cyclinD1(美國Epitomics公司)和Survivin(美國Cell Singaling公司)，DAB試劑盒顯色(購自福州邁新公司)，光學顯微鏡觀察。

1.2.2 免疫組化結果判讀:TNF-α、SOD-2和Survivin蛋白陽性的評定標準：細胞質內可見棕黃色或棕褐色顆粒。免疫組化染色結果評判標準為：每張切片隨機選取5個高倍視野(40×)，光學顯微鏡下觀察細胞著色程度，同時計數每個高倍視野中陽性細胞數所占的百分比進行評分：①陽性細胞數≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；②細胞陽性反應強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將①和②兩者相乘得分結果≤4分判讀為陰性，>4分判讀為陽性。CyclinD1蛋白的評定標準：細胞核可見棕黃或棕褐色顆粒評定為陽性。免疫組織化學染色結果判斷標準為：每張切片隨機計數5個高倍視野(40×)，光學顯微鏡下觀察細胞著色程度，按陽性細胞所占的百分比進行評判：陽性細胞<5%判定為陰性；陽性細胞≥5%判定為陽性。

2 結果

2.1 炎性細胞因子TNF-α、SOD-2和增殖相關蛋白Survivin、CyclinD1在人肺腺癌組織中的表達情況 TNF-α、SOD-2和Survivin陽性表達為細胞漿出現棕黃色或棕褐色顆粒。CyclinD1陽性表現為細胞核呈棕黃色。上述指標在肺腺癌標本中的部分病例為陽性，正常對照肺組織中可見少量陽性表達細胞。免疫組化結果顯示，68例肺腺癌標本中TNF-α的陽性率為82.4%(56/68)，正常肺組織中只有2例陽性，陽性率為10%(2/20)(χ2=36.007，P=0.000)。SOD-2陽性標本有33例，陽性率為48.5%(33/68)，而正常肺組織中4例陽性(χ2=5.162，P=0.023)。增殖相關蛋白Survivin和CyclinD1在68例肺腺癌中，陽性例數分別為42例和34例，陽性率分別為61.8%和50.0%，和正常肺組織比較，有明顯差異(χ2=36.007，P=0.000；χ2=7.769，P=0.005)。見圖1，表1～4。

圖1 2組TNF-α、SOD-2、Survivin 和CyclinD1蛋白的表達(免疫組×40)

表1 TNF-α在肺腺癌組織中的表達情況 例

表2 SOD-2在肺腺癌組織中的表達情況 例

表3 Survivin在肺腺癌組織中的表達情況 例

表4 CyclinD1在肺腺癌組織中的表達情況 例

2.2 肺腺癌中TNF-α與SOD-2的相關性分析 56例TNF-α蛋白表達陽性肺腺癌組織中，SOD-2同時為陽性的有31例，二者存在正相關關系(r=0.295，P=0.015)。見表5。

表5 肺腺癌組織中TNF-α和SOD-2表達的相關性 例

2.3 肺腺癌組織中SOD-2與增殖相關蛋白Survivin和CyclinD1的相關性分析 在33例SOD-2陽性表達的肺腺癌組織中，Survivin同時為陽性的有26例，而在35例SOD-2陰性的標本中，只有16例Survivin呈陽性，通過Spearman等級相關檢驗顯示二者呈正相關關系(r=0.340，P=0.004)。同樣，在33例SOD-2陽性表達的標本中，CyclinD1陽性表達例數為27例，35例SOD-2陰性表達的標本中，CyclinD1陽性例數為7例，二者呈明顯正相關關系(r=0.618，P=0.000)。見表6、7。

表6 肺腺癌組織中SOD-2和Survivin表達的相關性 例

表7 肺腺癌組織中SOD-2和CyclinD1表達的相關性 例

2.4 肺腺癌患者的臨床病理特征和SOD-2對生存預后影響的分析

2.4.1 分析肺腺癌患者的臨床病理特征:對68例肺腺癌患者進行電話隨訪，隨訪時間5個月到60個月，平均26.3個月。其中死亡47例，12例健在，9例失訪，失訪率為13.2%?；颊吣信壤秊?.89∶1(32/36)；平均年齡60.0歲，>50歲患者為≤50歲患者的4.67倍(56/12)；低分化患者與高分化、中分化患者的人數之比為0.48∶1(22/46)；患者有淋巴結轉移與無淋巴結轉移的人數之比為0.66(27/41)。見表8。

2.4.2 肺腺癌患者SOD-2表達與臨床病理特征的關系:統計學結果顯示，在27例有淋巴結轉移的肺腺癌標本中，20例存在SOD-2蛋白陽性表達(χ2=11.698，P=0.001)，結果提示SOD-2陽性表達和肺腺癌淋巴結轉移有關。但是SOD-2的表達與患者性別、年齡及癌組織分化程度均無相關性(P>0.05)。見表8。

表8 肺腺癌患者SOD-2表達和臨床病理特征之間的關系 例

2.4.3 肺腺癌患者SOD-2表達和臨床病理特征對生存時間的影響:Kaplan-Meier生存曲線顯示：肺腺癌患者淋巴結轉移及癌組織分化程度和生存時間相關(χ2=14.227，P=0.000；χ2=4.184，P=0.041)，而患者的年齡及性別和其生存時間無相關性(χ2=3.694，P=0.055；χ2=0.025，P=0.874)；SOD-2表達和患者生存時間也存在相關性，高表達SOD-2組患者的生存時間明顯低于低表達SOD-2患者(χ2=5.766，P=0.016)。見圖2。

圖2 肺腺癌患者臨床特征和SOD-2的生存曲線

3 討論

肺癌是目前全球最具挑戰性的健康問題之一，其死亡率比乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌加起來還要多[9]，是我國目前惡性腫瘤導致死亡的首要原因[1,2]。肺癌分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌，其中NSCLC占到85%，而肺腺癌又是NSCLC最常見的肺癌亞型。多項研究結果顯示，環境污染物如煙草、汽車尾氣及真菌毒素等都可以促進肺癌的發生發展[3-6]。我組前期研究結果顯示：灌胃AFG1可以誘發小鼠肺部慢性炎癥，并最終致肺腺癌[7]。并發現在AFG1誘導小鼠肺腺癌組織中炎癥細胞因子TNF-α表達明顯升高，同時SOD-2蛋白表達也升高[8]。惡性腫瘤的特征就是腫瘤細胞的失控性增殖，在AFG1誘發的小鼠肺腺癌標本中，我們發現CyclinD1、Survivin、PCNA、BCL-XL這些增殖及抗凋亡相關指標均表達升高，說明肺腺癌細胞增殖增加。因此，本研究選取人肺腺癌手術標本，免疫組織化學方法檢測炎癥細胞因子TNF-α、SOD-2及增殖相關蛋白CyclinD1和Survivin的表達。結果發現TNF-α、SOD-2、Survivin和CyclinD1蛋白在肺腺癌組織中表達均升高，陽性率分別為82.4%、48.5%、50.0%和61.8%。

SOD-2是一種抗氧化金屬酶，在機體的氧化與抗氧化平衡關系中發揮重要的作用，與很多疾病的發生發展有關。SOD-2不僅參與腫瘤的浸潤轉移，還和腫瘤細胞的增殖密切相關，但SOD-2的表達在不同類型的腫瘤中對腫瘤細胞增殖的作用并不一致，其既是一個抑癌基因，又是一個促癌基因[10]。Jeon等[11]發現蛋白激酶C誘導的SOD-2過表達抑制腫瘤細胞增殖。在具有侵襲性甲狀腺濾泡細胞癌小鼠中，SOD-2的過度表達降低了腫瘤的增殖[12]。Guo等[13]的研究指出，細胞穿透肽TAT處理后的SOD-2刺激對肝癌細胞的增殖有明顯的抑制作用。也有不同的文獻報道，Hemachandra等[14]發現SOD-2在卵巢透明細胞癌中高表達，而且隨著SOD-2表達的降低，細胞的增殖及遷移能力顯著降低。我組前期通過體外細胞培養試驗發現AFG1可以誘導炎癥細胞因子TNF-α表達升高，通過促進SOD-2高表達介導肺腺癌細胞發生EMT和促進侵襲[8]。為進一步探討炎癥細胞因子TNF-α-SOD2-肺腺癌細胞增殖之間的相互關系，我們通過Spearman等級相關檢驗分析發現，TNF-α和SOD-2蛋白表達呈正相關相關關系；SOD-2和增殖相關蛋白CyclinD1、Survivin的蛋白表達同樣呈正相關關系，綜合以上實驗結果進一步證實：炎癥細胞因子TNF-α通過誘導SOD-2表達，促進了肺腺癌細胞的增殖。

部分研究認為，SOD2和腫瘤的進展預后密切相關，并且可以作為預測預后的獨立指標。在人類口腔鱗狀細胞癌，尤其是中分化或低分化癌患者和早期頰黏膜癌患者中，SOD2高表達與好的生存率密切相關[15]。Chang等[16]在腺樣囊性癌中的研究中發現，SOD-2表達上調與遠處轉移、總生存期和無病生存期降低有關。Ding等[17]使用定量蛋白質組學分析，檢測15例肝細胞癌患者和15例健康對照者唾液樣本之間的蛋白表達差異，結果發現肝細胞癌患者SOD-2表達升高，提示SOD-2可能成為檢測肝細胞癌的潛在唾液生物標志物。因此，我們通過回顧性研究判斷SOD-2蛋白表達和肺腺癌患者臨床病理學意義及與生存時間的關系。結果發現，68例肺腺癌標本中有27例有淋巴結轉移，這27例淋巴結轉移病例中有20例SOD-2蛋白陽性表達，提示SOD-2表達和肺腺癌淋巴結轉移有關，SOD-2高表達肺腺癌患者更容易發生淋巴結轉移。但是SOD-2蛋白表達與患者性別、年齡及腫瘤分化程度均無相關性。我們又通過Kaplan-Meier生存曲線分析SOD-2蛋白表達與患者生存時間的關系，結果顯示SOD-2高表達組患者的生存時間明顯低于低表達組，提示我們SOD-2高表達是肺腺癌患者不良預后的獨立因素。

綜上所述，我們認為炎癥細胞因子TNF-α介導的SOD-2表達升高，可能誘導肺腺癌細胞增殖。SOD-2高表達和患者的不良生存預后相關，可以作為肺腺癌患者預測預后的獨立指標。