低分子肝素對頸動脈球囊損傷模型大鼠AngⅡ、HB-EGF表達及內膜增生的影響

趙治濤 肖珂青

近年來，隨著社會壓力增大和老齡化加重，心血管疾病已成為威脅人類生命健康的主要原因之一[1,2]。由冠狀動脈硬化(coronary atherosclerosis,CAS)引起的冠心病是心血管疾病的主要類型，也是導致心血管病患者死亡的主要原因之一[3]。目前，臨床上治療冠心病的主要方法是經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)，但PCI術后可引起血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)過度增殖、內膜異常增生、遷移，導致冠狀動脈再狹窄、硬化等[4]。而頸動脈球囊損傷術所導致的血管內皮剝落和VSMC增生，與人類 PCI 術所引起的冠脈狹窄及CAS病理變化過程相似，因此復制動物頸動脈球囊損傷模型，可模擬人類PCI 術血管內膜增生病變過程[5]。目前，抑制PCI 術后VSMC增生、遷移是心血管臨床研究的難點和熱點之一[6]。研究發現在病理因素刺激下，血管緊張素Ⅱ(Angiotensin，AngⅡ)和肝素結合性表皮生長因子(Heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)異常表達，可誘導并促進VSMC的異常增殖、遷移及表型轉化[7,8]，因此調控AngⅡ和HB-EGF的表達，可能對抑制人類PCI 術血管內膜增生病變有潛在的臨床價值。低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)具有抗炎、抗凝血作用[9]，研究發現，LMWH可被用于預防PCI 術后血栓形成[10]，但LMWH對PCI 術血管內膜增生病變及AngⅡ和HB-EGF的調控作用，筆者發現報道較少。本研究建立大鼠頸動脈球囊損傷術復制人類PCI 術病理血管內膜增生病變過程，探究LMWH給藥期間，血管內膜增生變化及AngⅡ和HB-EGF蛋白的調控作用LMWH治療人類PCI術并發癥的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取清潔級健康雌性SD大鼠52 只，體重 200～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(粵)2018-0002，動物質量合格證號為省科委2000A027。所有大鼠于本院動物房中飼養，飼養條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25℃，相對濕度50%，噪音<80分貝，保持動物房環境及鼠籠清潔、透氣。本研究經本院動物倫理委員會批準同意。試驗符合3R原則。

1.2 試劑及儀器 LMWH(貨號：140646-201002，購自上海雅吉生物科技有限公司)；白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)酶聯免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號：K-F5988，購自上?？祈樕锟萍加邢薰?；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號：F12999，購自上海研謹生物科技有限公司)；AngⅡ抗體、HB-EGF抗體、縫隙連接蛋白43(Connexin 43，Cx43)抗體(貨號分別為：ab236317、ab175555、ab230523，均購自美國abcam公司)；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-Eosin，HE)染色試劑盒(貨號：LMO105，購自上海聯邁生物工程有限公司)；總RNA提取(Trizol)試劑盒、反轉錄試劑盒(貨號分別為：T6126、T1597，均購自日本TAKARA)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號分別為P0768，P0231，均購自美國Pierce 公司)；實時熒光定量 PCR 儀(型號：Mastercycler nexus X2，購自德國Eppendorf艾本德)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號分別為1659001、Trans-Blot SD，均購自美國Bio-Rad公司)等。

1.3 大鼠頸動脈球囊損傷模型建立及分組給藥 參照文獻[11]制備大鼠頸動脈球囊損傷模型，具體操作方法為：取42只健康SD雄性大鼠，用3%戊巴比妥鈉麻醉后，于頸部正中切口，分離出左側頸總動脈、頸外動脈，并將頸外動脈遠端結扎，臨時阻斷頸左、頸總動脈血流，將2.0 mm×12.0 mm的球囊導管由頸外動脈插入至頸總動脈后，將球囊充盈，并緩慢反復來回抽動球囊3次，確保血管內膜損傷后，退出球囊，然后將頸外動脈結扎。術后給予30萬單位青霉素肌內注射，3 d，1次/d以預防感染。術后第4天，隨機取2只，處死取頸動脈組織，HE染色，若血管組織內膜有增厚現象，表明造模成功，共造模成功40只，隨機分為模型組、LMWH低(50 U/kg)、中(100 U/kg)、高(200 U/kg)劑量組，每組10只；另取10只雄性SD大鼠，只暴露并分離左側頸外、頸總動脈，不結扎、不進行球囊損傷，其余操作同模型組，作為假手術組。5組均于造模成功后開始給藥，LMWH藥物參照文獻[12]以0.9%氯化鈉溶液配置為5.00、10.00、20.00 U/kg的混懸液，以10 ml/kg的劑量經尾靜脈注射給藥；假手術組與模型組經尾靜脈給予等劑量0.9%氯化鈉溶液，5組連續給藥14 d，1次/d。

1.4 觀察指標

1.4.1 5組頸動脈血管組織HE染色：5組大鼠，于末次給藥24 h后，隨機取5只，處死，取頸動脈血管組織，置于-80℃冰箱保存，剩余5只，處死后取頸動脈血管組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，進行常規透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片，按HE染色試劑盒說明書進行染色、脫水、透明后封片，置于光學顯微鏡下觀察組織病理變化，并使用(Image-ProPlus,IPP)圖像分析軟件對損傷血管的管腔面積、內膜面積、中膜面積進行測量，并計算內膜/中膜的面積(IA/MA)比。

1.4.2 5組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α含量檢測:取1.4.1中-80℃冰箱保存的血管組織約0.5 g，于4℃冰箱中解凍后，用組織勻漿器勻漿、離心分離后，取上清液，按 ELISA試劑盒說明書方法檢測IL-6、TNF-α含量。

1.4.3 qRT-PCR檢測5組大鼠血管組織HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對表達水平:取-80℃冰箱保存頸動脈血管組織約0.5 g，于4℃冰箱中解凍后，用Trizol試劑盒抽提總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書以總RNA為模板，逆轉錄cDNA，按RT-qPCR試劑盒(SYBR Green)和PCR儀進行擴增，36個循環，以β-actin為內參，嚴格按試劑盒說明建立反應體系及參數，檢測5組大鼠血管組織中HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對表達量，qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt算法計算HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對表達量。見表1。

表1 q-RT-PCR引物序列

1.4.4 Western Blot檢測血管組織中HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白相對表達水平:取-20℃冰箱保存的上清液，于4℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度后，取50 μg蛋白進行電泳、轉膜反應后，置于5%的脫脂奶粉溶液中，于搖床上37℃封閉2 h，將目的蛋白條帶，置于孵育盒中，加入抗體(HB-EGF、AngⅡ、Cx43、β-actin，1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000)于4℃冰箱中孵育過夜，經TBST漂洗3次，加入1∶1 000的羊抗兔二抗溶液，于搖床上室溫孵育2 h，經TBST再次漂洗3次，采用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析5組蛋白相對表達。

2 結果

2.1 5組大鼠血管組織HE染色結果 假手術組大鼠頸動脈結構正常。與假手術組比較，模型組大鼠可見頸動脈內皮剝脫、部分內彈力板變平坦、失去彈性，血管內有新生內膜形成并增厚，且內膜血管平滑肌細胞增多，中膜血管平滑肌細胞排列紊亂，血管管腔呈向心或偏心性狹窄。與假手術組相比，LMWH低、中、高劑量組上述頸動脈內皮剝落、內膜增生及管腔狹窄等病理現象均有不同程度的改善。見圖1、2。

2.2 5組大鼠頸動脈血管組織管腔面積、內膜面積、IA/MA比值檢測結果 與假手術組比較，模型組大鼠血管內膜面積、IA/MA比值均顯著升高(P<0.05)，管腔面積顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠內膜面積、IA/MA比值均顯著降低(P<0.05)，血管管腔面積顯著升高(P<0.05)，且LMWH 3個劑量組上述指標呈劑量依賴性。見表1。

表1 5組大鼠管腔面積、內膜面積、IA/MA比較

2.3 大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α檢測結果 與假手術組比較，模型組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α均顯著降低(P<0.05)，且LMWH各劑量組上述指標呈劑量依賴性。見表2。

表2 5組大鼠血管組織炎性因子IL-6、TNF-α比較

2.4 5組大鼠血管組織中HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA相對表達水平檢測結果 與假手術組比較，模型組大鼠血管組織HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA表達均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠血管組織血管組織HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA表達均顯著降低(P<0.05)，且LMWH各劑量組上述指標呈劑量依賴性。見表3。

表3 5組大鼠HB-EGF mRNA、AngⅡ mRNA比較

2.5 5組大鼠血管組織中HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白相對表達水平檢測結果 與假手術組比較，模型組大鼠血管組織HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白表達均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠血管組織血管組織HB-EGF、AngⅡ、Cx43均顯著降低(P<0.05)，且LMWH 3個劑量組上述指標呈劑量依賴性。見圖3，表4。

圖3 5組大鼠血管組織HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白表達免疫印記圖;A 假手術組；B 模型組；C LMWH低劑量組；D LMWH中劑量組；E：LMWH高劑量組

表4 5組大鼠血管組織中織HB-EGF、AngⅡ、Cx43蛋白表達水平

3 討論

PCI術的是治療冠心病的主要有效手段之一，而PCI術后支架內再狹窄病變的發生率相對較高，是導致不良心血管事件發生率較高的主要原因之一[13]。血管內膜炎性細胞浸潤、內皮細胞增生、VSMC從中膜遷移至內膜而導致內膜增厚，是管腔狹窄的主要原因，而抑制血管內膜增厚、防止血管再狹窄是心血管病的研究熱點之一[14]。大鼠頸動脈球囊損傷術可造成血管管腔狹窄、內膜增厚，陳文明等[11]研究發現，大鼠頸動脈球囊損傷術后14 d可造成大鼠血管管腔狹窄、血管新生內膜面積增大；尉希清等[15]發現大鼠球囊損傷后24 h可引起VSMC增殖、遷移，14 d后內膜增生達到最高峰。本研究建立大鼠頸動脈球囊損傷術模型后發現，與假手術組相比，模型組大鼠頸動脈內皮剝落、有新生內膜形成，血管管腔呈向心、偏心性狹窄，且血管內膜面積、內膜/中膜面積(IA/MA)、血管組織中炎性因子IL-6、TNF-α均增高，管腔面積減小，提示Model 組大鼠血管組織出現血管內膜增厚和炎性反應，表明造模成功。

目前臨床上用于PCI 術的藥物如雷帕霉素、紫杉醇等，可阻止損傷部位 VSMC增殖。但由于上述藥物在阻止VSMC 增殖遷移的同時，也會干預損傷動脈血管再內皮化的進程，引起遲發性再狹窄、遲發性血栓形成，增加PCI術后心血管不良事件的發生[16]。因此尋找有效、安全的防治血管再狹窄藥物，具有重要的研究意義。LMWH對血管內膜增生具有抑制作用，孫夫強等[17]發現LMWH可抑制急性肺栓塞大鼠肺動脈內膜增殖。高志偉等[18]發現LMWH可抑制兔VSMC增殖。本研究發現，與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠頸動脈內皮剝落、內膜增生、狹窄等病理損傷現象減小，且血管內膜面積、內膜/中膜面積(IA/MA)、血管組織中炎性因子IL-6、TNF-α均降低，管腔面積增大，表明LMWH可抑制頸動脈球囊損傷模型大鼠血管內膜增厚，但具體分子機制還不甚明確。

正常生理狀態下，位于動脈中層的VSMC，可收縮血管、維持血管彈性，AngⅡ可誘導VSMC增殖和遷移。Zhang等[19]發現在病理誘導下，VSMC會異常增殖、遷移，并推測AngⅡ可能通過調節細胞周期因子，促進Cx43表達，而促進VSMC異常增殖、遷移。張坤等[20]發現杜鵑素可抑制Cx43表達，抑制AngⅡ誘導的VSMC增殖。本研究發現，與假手術組相比，模型組大鼠血管內膜組織中AngⅡ mRNA及蛋白、Cx43蛋白表達增高，提示VSMC增殖、遷移可能與血管內膜組織中AngⅡ、Cx43高表達有關。HB-EGF可促進細胞增殖、侵襲和遷移，與動脈粥樣硬化形成有關，Jiang等[21]發現在PCI術后冠脈再狹窄患者血清和血管組織中，HB-EGF基因及蛋白表達水平均高于正?；颊?，并推測HB-EGF 可能促進支架內的內膜增殖及血管重構，促進血管狹窄，是PCI冠脈再狹窄的危險因素之一；然而Rattik等[22]對384例發生急性冠狀動脈事件的患者血漿和組織中HB-EGF 水平進行檢測，發現其表達低于正常對照組，并推測HB-EGF 可能通過促進斑塊穩固來減少急性冠狀動脈事件的發生，HB-EGF可能是心血管疾病發生的一個保護因素。而本研究發現，模型組大鼠頸動脈血管組織中HB-EGF蛋白表達均高于假手術組，與Jiang等[21]研究一致，表明HB-EGF異常高表達可能促進內膜增殖、血管狹窄的發展。與模型組比較，LMWH低、中、高劑量組大鼠頸動脈血管組織中AngⅡ mRNA及蛋白、HB-EGF mRNA及蛋白、Cx43蛋白表達均降低，且各劑量組呈劑量依賴性。表明LMWH抑制頸動脈球囊損傷模型大鼠血管內膜增厚作用，可能與抑制AngⅡ、Cx43、HB-EGF 表達有關。

綜上所述，LMWH可抑制頸動脈球囊損傷模型大鼠頸動脈血管組織AngⅡ、HB-EGF基因及蛋白表達，抑制血管內膜增生。為臨床治療頸動脈球囊損傷及PCI術后冠脈再狹窄，闡明LMWH可能存在的新的分子藥理機制，提供一定的參考。但本研究也存在一定的不足，血管內膜增生及狹窄分子機制水分復雜，AngⅡ、HB-EGF參與血管內膜增生的靶標分子還不明確，這有待后續繼續研究。