體外培養細胞中細胞器的分離與純化

周夢，史熊杰

（武漢大學 生命科學學院，湖北武漢 430072）

在真核生物中，細胞內部被嚴格地組織成分門別類的細胞器[1]，它們各自擁有特殊的結構特征以及動態特性，發揮著不同的生物學功能。為了研究某一特定細胞器的微觀結構、生化組成以及特定的功能，需要將其從細胞中分離純化出來。在這個過程中，要求純化的細胞器結構完整、形態與細胞內無異、具有生物學活性，在數量足夠基礎上，提高純度、節省時間、提高效率、節約經濟成本。如在蛋白質組學的研究中，需要分離純化出純度較高的細胞器，以滿足電泳或色譜分離要求，從而建立相應的細胞器蛋白質組數據庫[2]。因此，針對分離的目的和后期鑒定要求，選擇合適細胞破碎溶劑、破碎方法以及分離純化方式對于純化的細胞器至關重要。細胞器分離純化方法分為離心分離、親和免疫純化分離、自由流電泳分離、熒光激活細胞器分選、光學鑷子和激光捕獲顯微解剖、雙向電泳分離等[3]，本文主要介紹離心和親和純化兩種分離方法，對這兩種分離純化方法的原理、操作步驟以及特點討論分析。

1 細胞器的釋放

理想的勻漿是成功分離純化細胞器的第一步，即細胞器等細胞成分能完整、均一地分布在勻漿液中[4]。在勻漿過程中，經常觀察到細胞質聚集體，這是因為細胞破碎不充分或不當，細胞器與圍繞在細胞核周圍的細胞骨架元素相聯系，或被困在大的聚集物中，形成大的細胞沉積團塊。這會導致在去除核的初始離心步驟中，細胞器大量損失，因此必須優化每個細胞系的均勻化條件[4]。

1.1 溶劑的選擇

在離心分離細胞器過程中，適用的溶劑通常是由細胞器的種類決定的[5]，每一步分離溶液成分都有所變化。最開始分離細胞器是以大鼠肝臟和其他軟組織為原材料，以離心分離為基本方式純化，因此這些試劑是以動物組織中細胞器分離的目的而發明的，通常含有蔗糖作為滲透平衡劑。許多培養的細胞也可以在通用培養基或其他類似的等滲培養基中均質[6]，但如果是在低滲介質中進行均質，則應盡快調整到推薦的蔗糖和其他添加劑濃度。本文列舉以下離心分離常見溶劑體系。（1）通用的勻漿溶劑：0.25 mol/L 的蔗糖，1 mmol/L 的EDTA，10 mmol/L 的Hepes-NaOH（或10 mmol/L 的Tris-HCl），pH=7.4；（2）細胞核：與通用的體系基本相同，只是將1 mmol/L的EDTA 換成25 mmol/L 的KCl，5 mmol/L 的MgCl2；（3）過氧化物酶體：在通用的體系上加入0.1%的乙醇；（4）線粒體：0.2 mol/L的甘露醇，50 mmol/L的蔗糖，1 mmol/L 的EDTA，10 mmol/L 的HEPES-NaOH，pH=7.4。

親和純化分離細胞器中，一般采用磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）作為溶劑，其主要成分是Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和KCl，其中Na2HPO4和KH2PO4可以通過二級解離起到緩沖作用，而NaCl 和KCl 主要作用為增加鹽離子濃度，使細胞里pH 和滲透壓保持不變，最大限度起到保護細胞的作用。對于特殊的細胞器純化，可在PBS 補加1 mmol/L 的CaCl2和0.5 mmol/L 的MgCl2，提供二價陽離子。雖然PBS 適用范圍很廣，但是針對于某些細胞器的親和純化需要改進溶液體系，如加入KCl的緩沖液可以分離出能夠支持膜電位的耦合的線粒體[7]。因此，2016 年來自于劍橋大學CHEN 等[8]開發了一種僅由KCl 和KH2PO4組成的LC/MS 兼容的緩沖液KPBS，能顯著提高純化效率。越來越多的學者選擇KPBS 來代替PBS，不僅局限于純化線粒體，也包括溶酶體和過氧化物酶體等[1]。

1.2 細胞破碎

常見的細胞破碎方法分為玻璃勻漿器法、超聲波破碎法、化學法和液氮反復凍融法。

（1）玻璃勻漿器法。玻璃勻漿器法是最常用的細胞器破碎方法，勻漿器一般由一根底端為球形表面磨砂的玻璃桿和一個內壁磨砂的玻璃套管組成，研缽磨球和玻璃管內壁之間間隙保持在幾微米距離。使用時，將剪碎的組織或細胞懸液加入勻漿管中，然后將研磨桿放入玻璃套管上下移動數次，即可將細胞破碎。

（2）超聲波處理法。超聲波破碎儀能產生固定頻率的超聲信號，聲波形成沖擊和振動會產生一定的剪切力，致使細胞破碎。超聲破碎儀耗時短且省力，但是在超聲時會產熱，因此在超聲時應將材料置于冰浴中，避免溫度升高造成生物大分子失活。

（3）化學裂介法。處理前，常需要在破碎過程中加入表面活性劑，常見的表面活性劑有Triton-100、NP-40、SDS 以及脫氧膽酸鈉等，然后加以機械輔助，如用針頭裂解。這類化學試劑可以改變細胞膜的通透性使生物大分子從細胞中釋放出來，從而達到細胞破碎的目的，注意后續操作中應將這些表面活性劑清除，避免影響分析。

（4）反復凍融法。將制備好的組織或細胞懸液放在液氮中冷凍后，然后在室溫或者37 ℃融化，經過3 ～4 次凍融周期，可使細胞破碎。

2 細胞器的分離純化

2.1 離心分離純化法

2.1.1 背景及原理

離心法分離中離心轉子的旋轉產生離心場和離心力，離心力作用于離心場中的粒子并取決于粒子的質量、旋轉速度和離旋轉中心的距離[9]。離心分離技術原理非常簡單，根據細胞器的大小、密度、沉降系數不同，采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時間下分批分離的方法。1974年，來自洛克菲勒和紐約大學的DUVE、CLAUDE 和PALADE 發現并總結了現代微觀分析技術和密度梯度離心的基本原理，并使用離心技術成功分離來自大鼠肝臟的細胞器而共同獲得了諾貝爾生理學或醫學獎[10]。如今，隨著離心機種類增多和功能不斷完備，離心技術已經成為實驗室中分離細胞器使用最廣泛和可信的手段，離心機的分類（按轉速）見表1。

表1 離心機的分類（按轉速）

2.1.2 離心分離過程

在離心分離純化細胞器過程中，分為差速離心和密度梯度離心。差速離心是根據離心機不同轉速下產生不同離心力，將各種細胞器進行分離的，其一般操作過程如圖1 所示。

圖1 差速離心的一般過程

因此，差速離心需要多次離心以達到分離不同組分的目的。盡管如此，得到的細胞器純度并不高，所以實驗室在分離純化細胞器的過程中往往還會在差速離心分離的基礎上，將得到的沉淀利用密度梯度離心進行再分離。

密度梯度離心法是由BRAKKE 在1951 年發明的[9]，用于根據物質的密度分離樣品。用這種方法分離細胞器，梯度液的配制是一個要點，常見的配制梯度液的介質有蔗糖、Ficoll[11]、Percoll、碘化介質（OptiPrep，Nycodenz 及metrizamide）等[12]。因蔗糖溶液配制簡單，材料易得而且價格低廉，實驗室中多采用蔗糖作為密度梯度液來分離細胞器。但是蔗糖本身在不同密度都具有一定的滲透性，分離滲透性敏感的細胞器如溶酶體，需要用其他材料代替。

根據以往的文獻報道，密度梯度離心分離純化細胞器常見的介質以及轉速如表2 所示。

表2 細胞器分離推薦使用的密度梯度和離心條件

總的來說，用離心分離法純化細胞器可以處理大批量材料，成本低，適用性廣。但是離心分離法的缺陷也很明顯：第一，純度低，達不到生化分析尤其是在蛋白質組學分析要求[1]；第二，耗時耗力，不適用于分析細胞內某些信號分子或者不穩定小分子代謝物，如溶酶體攜帶了氧化鐵共軛右旋糖酐后，離心分離無法去除這部分溶酶體[13]，因為隨著載入和追逐時間的延長，梯度液在不同的核內體和溶酶體中都有不同程度的富集[14]，且長期積累不可降解的右旋糖酐可能會對溶酶體功能產生一些意想不到的影響[15]；第三，離心分離過程中需要的各種類型的離心設備價格昂貴，對于缺乏相應設備的實驗室來說可能無法進行相關實驗。

2.2 親和純化

2.2.1 原理及背景

親和純化，最開始被稱為免疫分離。1978 年ITO和PALADE 提出了免疫分離亞細胞器的方法，隨后多個研究小組以此為基礎進行了方法研究，每種方法都使用了不同的固體載體和原理[16]。親和純化依賴于暴露在抗原外表面的抗原位點的存在，利用抗原抗體特異性識別結合特性，而不是細胞器的物理特性。識別抗原的抗體通常與一個固體載體結合，一般稱為磁珠，通過含有特異性抗體的磁珠將細胞器與其他成分分離，因此親和純化的限制性因素是特異性抗體的制備[3]。而細胞器標志蛋白的發現、抗體數量增加和蛋白標記技術飛速發展使這項技術得到了廣泛的應用。

2.2.2 純化過程

親和純化一般流程如圖3 所示。以從體外培養的細胞中純化細胞器為例，實驗室常用的做法是構建穩定特異性表達細胞器標志蛋白和標簽蛋白的融合蛋白的細胞株，將一定量的細胞株勻漿后，用勻漿液與磁珠結合一定時間，用等滲緩沖液清洗和去除不必要的污染物，最后用多肽或者其他競爭性洗脫液洗脫。細胞器親和純化技術可用于分離包括質膜[17]、突觸囊泡[18]、葉綠體[19]、線粒體[20]、過氧化物酶體[21]和溶酶體[22]等細胞器。

相對于離心分離，親和純化分離細胞器優勢明顯：（1）速度快，對于分析某些信號分子和代謝物來說適用；（2）特異性強，分離純化得到的細胞器純度高；（3）分離過程中不涉及一些大型的實驗設備和復雜的過程，可操作性強，從而克服了傳統方法的一些缺點。但是，親和純化分離細胞器也有包括抗體親和純化需要大量的抗體、用多肽洗脫細胞器效率不高等問題。

3 細胞器純化分離后鑒定

細胞器純化分離后需要鑒定細胞器的純度和完整性。常見的鑒定細胞器完整性方法是胰蛋白酶消化實驗、定量Western Blot 鑒定純度輔助質譜分析。用雙向凝膠電泳也可以對分離的細胞器組分進行定量和定性分析[17]。對于所有組分的形態分析，可以采用標準的電子顯微鏡程序[4]。

圖2 親和純化一般流程

4 結語

隨著現代生物學的發展，人們對各種細胞器的功能以及相關蛋白的研究越來越深入。高效快速的分離純化純度較高的單個細胞器對于后續蛋白質組學分析起著重要作用。因此，在純化分離細胞器的過程中應該根據實驗目的，在試劑、破碎方法、純化方式中綜合設計最佳方案。

傳統的離心分離處理批量大、適用性廣、穩定可靠，但處理過程耗時耗力而且有時達不到理想的純度。親和純化是現在比較受歡迎的純化方式，純化速度快，特異性強，純度高，但適用于小批量純化，受限于抗體的可用性，且磁珠價格昂貴。未來生物學的發展將不斷改進這些試驗方法的缺陷，細胞的分離純化方式將會得到更進一步完善。