家兔甲狀旁腺自體移植方法的對比研究

李君茹,趙 舸

(山西醫科大學第二臨床醫學院普通外科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:13835103128@qq.com)

近年,甲狀腺癌發病率不斷上升。據報道,甲狀腺全切除術后,約有40.0%的患者會被暫時性的甲狀旁腺功能減退困擾[1,2],而有0.4%-32.0%的患者會因永久性的甲狀旁腺功能減退降低生活質量[3-5]。由于目前沒有對應藥物可以完全替代甲狀旁腺的功能,自1926年Lahey[6]首次通過甲狀旁腺即時自體移植的方式治療甲狀旁腺功能減退并取得療效以來,甲狀旁腺即時自體移植技術成為目前保護甲狀旁腺、避免術后永久性甲狀旁腺功能減退的唯一替代方法,新的即時自體移植方法不斷被提出。然而由于臨床標本的收集較困難,對人體移植的甲狀旁腺組織形態的觀察較少被報道。El-Sharaky等[7]對3名進行了前臂肱橈肌甲狀旁腺自體移植的患者于移植后第1,2,4周進行了移植物的電子顯微鏡檢查,雖然從細胞層面上對移植的甲狀旁腺細胞進行了研究,但是樣本量少,且只對一種移植方法進行了研究,無法為臨床選擇移植方法提供借鑒。本實驗對家兔進行了肌肉顆粒包埋、皮下顆粒包埋、肌肉勻漿注射、皮下勻漿注射4種甲狀旁腺即時自體移植方法的研究,觀察移植效果,以求從組織學角度進一步對比研究4種方法移植的甲狀旁腺的情況,為臨床提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

取健康成年家兔30只(購于山西醫科大學實驗動物中心),雌雄不限,體質量2 500-3 000 g,籠養。

1.2 實驗分組及移植方法

實驗動物隨機分為對照組、肌肉顆粒包埋組、皮下顆粒包埋組、肌肉勻漿注射組、皮下勻漿注射組,每組6只。用10%水合氯醛50-75 mg/kg腹腔注射麻醉,生效后,將家兔仰臥位固定,手術部位剪毛、備皮、消毒。自甲狀軟骨至胸骨上切跡做縱向切口,逐層切開,隨機于一側氣管食管溝及甲狀腺周圍探查,顯露下甲狀旁腺。

對照組:僅進行甲狀旁腺的探查及暴露。其余各組均游離家兔的下甲狀旁腺并完整切除。肌肉顆粒包埋組:將甲狀旁腺組織剪碎成直徑不超過1 mm的顆粒,并埋入家兔一側胸鎖乳突肌的肌腹中。皮下顆粒包埋組:將甲狀旁腺組織剪碎成直徑不超過1 mm的顆粒,于家兔腿部皮膚切開約10 mm切口,緊貼真皮層分離出2-3個囊袋,將組織顆粒植入其中。肌肉勻漿注射組:將甲狀旁腺組織剪碎后,在0.5 ml生理鹽水中將組織碎屑進一步研磨至近似勻漿,使用1 ml注射器將勻漿注射于家兔一側胸鎖乳突肌的肌腹中。皮下勻漿注射組:制作勻漿的方法同前。在家兔腿部皮膚切開約10 mm切口,緊貼真皮層分離出2-3個囊袋,使用1 ml注射器將勻漿注射入囊袋中。

手術過程中,離體的甲狀旁腺于室溫(22-24 ℃)下保存于生理鹽水中,甲狀旁腺離體時間不超過30 min,所有移植方式均采用多點即時自體移植。

手術過程中分別記錄顆粒制作時間、勻漿制作時間及移植時間(從開始處理離體甲狀旁腺組織到移植完畢)。

1.3 HE染色及組織形態學檢查

將手術后的每組家兔隨機分為3組,分別于移植后第1,2,3周再次麻醉,于相應部位取出對照組探查的甲狀旁腺及其他各組移植甲狀旁腺的組織進行取材、4%多聚甲醛固定24 h、梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋、切片(切片厚度8 μm)、展片、烤片、脫蠟、復水、染色、脫水、封片,在光學顯微鏡下尋找組織中的甲狀旁腺細胞,對甲狀旁腺細胞的分布、變性及死亡情況進行組織形態學檢查。

在光學顯微鏡下尋找各組所收集標本中的甲狀旁腺細胞并拍攝照片,取移植后第1,2,3周每組甲狀旁腺細胞密集處的40個隨機400倍視野,照片用Image Pro Plus 6.0軟件分析空泡變性所占甲狀旁腺細胞的面積比以及細胞死亡所占甲狀旁腺細胞的面積比。

1.4 統計學分析

肌肉顆粒包埋組、皮下顆粒包埋組、肌肉勻漿注射組、皮下勻漿注射組的空泡變性、細胞死亡所占面積比分別與對照組行兩獨立樣本均數的t檢驗,四組之間進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 形態學檢查

2.1.1 移植不同時間形態學表現 移植后第1周,對照組以大量巢狀分布的主細胞為主,有血管穿行其中,為正常甲狀旁腺形態(見圖1A)。肌肉顆粒包埋組移植的甲狀旁腺組織多呈巢狀分布于肌肉組織中,可觀察到大量存活的甲狀旁腺細胞,部分細胞空泡變性,部分細胞死亡,形成一片顆粒狀無定形的紅染物(見圖1B)。皮下顆粒包埋組皮下組織內可見甲狀旁腺細胞;移植的甲狀旁腺細胞呈團狀分布,可觀察到大量存活的甲狀旁腺細胞,部分細胞空泡變性(見圖1C)。肌肉勻漿注射組可觀察到大量存活的甲狀旁腺細胞穿插于肌肉組織中,少量細胞空泡變性,部分細胞死亡成為失去細胞結構的紅染物(見圖1D)。皮下勻漿注射組可見大量存活的甲狀旁腺細胞散在分布于皮下組織中,周圍被纖維結締組織及脂肪組織浸潤,有血管穿行其中,少量細胞空泡變性,少量細胞死亡成為失去細胞結構的紅染物(見圖1E)。

圖1 術后第1周移植組織染色 (×400)Figure 1 Staining of transplanted tissue at week 1 after surgery (×400)

移植后第2周,對照組以大量巢狀分布的主細胞為主,有血管穿行其中,甲狀旁腺細胞形態正常(見圖2A)。肌肉顆粒包埋組移植的甲狀旁腺組織多呈巢狀分布于肌肉組織中,可見大量存活的甲狀旁腺細胞,部分細胞空泡變性,部分細胞死亡,成為失去細胞結構的紅染物(見圖2B)。皮下顆粒包埋組移植的甲狀旁腺細胞呈散在或巢狀分布,可見大量存活的甲狀旁腺細胞,有大量新生的血管穿行其中(見圖2C)。肌肉勻漿注射組可見大量存活的甲狀旁腺細胞散在分布,有新生的血管穿行其中,少量細胞死亡成為失去細胞結構的紅染物(見圖2D)。皮下勻漿注射組可見大量存活的甲狀旁腺細胞散在分布,有新生的血管穿行其中(見圖2E)。

圖2 術后第2周移植組織染色 (×400)Figure 2 Staining of transplanted tissue at week 2 after surgery (×400)

移植后第3周,對照組以大量巢狀分布的主細胞為主,有血管穿行其中,甲狀旁腺細胞形態正常(見圖3A)。肌肉顆粒包埋組移植的甲狀旁腺組織呈巢狀分布于肌肉組織中,有新生的血管穿行其中(見圖3B)。皮下顆粒包埋組移植的甲狀旁腺組織呈巢狀分布,有新生的血管穿行其中(見圖3C)。肌肉勻漿注射組可見散在分布的甲狀旁腺細胞穿插于肌肉組織中,有大量新生血管穿行其中(見圖3D)。皮下勻漿注射組可見甲狀旁腺細胞散在分布,有新生血管穿行其中(見圖3E)。

圖3 術后第三周移植組織染色 (×400)Figure 3 Staining of transplanted tissue at week 3 after surgery (×400)

2.1.2 各組組織形態學的統計分析 術后第1周,與肌肉顆粒包埋組相比,皮下顆粒包埋組、肌肉勻漿注射組和皮下勻漿注射組空泡變性、細胞死亡所占面積比較低(P<0.05,見表1,2);與肌肉勻漿注射組相比,皮下勻漿注射組空泡變性所占面積比較低(P<0.05,見表1)。肌肉顆粒包埋組、皮下顆粒包埋組、肌肉勻漿注射組、皮下勻漿注射組移植的甲狀旁腺細胞空泡變性、細胞死亡所占面積比在術后第1周較對照組更高(P<0.05),在術后第3周與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05,見表1,2)。

表1 對照組、肌肉顆粒包埋、皮下顆粒包埋、肌肉勻漿注射、皮下勻漿注射組空泡變性所占面積比Table 1 The area percentage of cellular swelling in control group, intramuscular granule embedding group, subcutaneous granule implantation group, intramuscular homogenate injection group and subcutaneous homogenate injection group

表2 對照組、肌肉顆粒包埋、皮下顆粒包埋、肌肉勻漿注射、皮下勻漿注射組死亡細胞所占面積比Table 2 The area percentage of cell death in control group, intramuscular granule embedding group, subcutaneous granule implantation group, intramuscular homogenate injection group and subcutaneous homogenate injection

2.2 各組顆粒制作時間、勻漿制作時間及移植時間的統計分析

勻漿制作時間為(5.90±0.58)min;顆粒制作時間為(2.21±0.73)min,兩者差異有統計學意義(t=13.754,P<0.05)。

肌肉顆粒包埋組移植時間與皮下顆粒包埋組移植時間差異無統計學意義(P>0.05),其余各組之間移植時間的差異有統計學意義(P<0.05),皮下勻漿注射組操作最耗時(見表3)。

表3 肌肉顆粒包埋、皮下顆粒包埋、肌肉勻漿注射、皮下勻漿注射組移植時間Table 3 Autotransplantation time in intramuscular granule embedding group, subcutaneous granule implantation group, intramuscular homogenate injection group and subcutaneous homogenate injection

3 討論

隨著新的甲狀旁腺即時自體移植方法及移植部位不斷被提出,如何在保證手術效率的前提下選擇成活率最高的移植方式成為臨床醫生新的困擾。Murray[8]提出將鏡下顯示移植物存活作為內分泌移植成功的評價標準之一。組織學的研究能夠對臨床移植方法的選擇提供一些參考。因此,本實驗通過建立動物模型,從組織學上對移植部位甲狀旁腺細胞的情況進行了觀察。El-Sharaky等[7]研究發現,移植后的甲狀旁腺大約在術后第2周開始顯示出增生和活性。本研究參考移植甲狀旁腺的恢復規律,分別于移植后第1,2,3周取標本直觀地對比研究甲狀旁腺細胞存活的規律,以求從組織學角度進一步研究移植甲狀旁腺的情況,不僅為實驗家兔模型提供了一個有價值的研究平臺和空間,而且對臨床上移植方法的選擇和改進也具有一定價值。

就移植方法而言,顆粒包埋法、勻漿注射法及帶蒂血管甲狀旁腺移植[9]是目前甲狀旁腺自體移植的主要方法。將甲狀旁腺組織切成盡可能小的顆粒,使移植物與周圍組織之間有更大的接觸面積,有利于新生血管的生成從而盡早建立有效的血運。許志亮等[10]通過測量病人術后血鈣和PTH值的方法,比較了3種常用自體移植方式,認為多點勻漿注射法可以使甲狀旁腺功能更快恢復。本研究通過組織學觀察顯示,術后第1周肌肉勻漿注射組空泡變性所占面積比與肌肉顆粒包埋組相比較低(P<0.05),肌肉勻漿注射法優于肌肉顆粒包埋法;而皮下顆粒包埋組和皮下勻漿注射組之間無明顯差異(P>0.05)。同時我們觀察到,與顆粒包埋法相比,勻漿注射法移植的甲狀旁腺細胞多呈散在分布,可以與周圍的組織更加充分的接觸。從時間上看,肌肉顆粒包埋組移植時間與皮下顆粒包埋組移植時間差異無統計學意義(P>0.05),其余各組之間移植時間的差異有統計學意義(P<0.05)。肌肉顆粒包埋法和皮下顆粒包埋法較其他方法更快捷,最耗時的是皮下勻漿注射法。制作顆粒比制作勻漿更加快捷(P<0.05)。

從移植部位上,目前常見的甲狀旁腺的自體移植部位有胸鎖乳突肌、腹部皮下脂肪組織、前臂肌肉、前臂皮下組織、胸骨前皮下組織、三角肌、脛骨前肌、前臂腕屈肌前筋膜[11]等。本研究中,皮下顆粒包埋、肌肉勻漿注射、皮下勻漿注射三種方法均在術后第2周移植部位觀察到了新血管的生成及大量甲狀旁腺細胞,肌肉顆粒包埋組在術后第3周觀察到新生血管。術后第1周,與肌肉顆粒包埋組相比皮下顆粒包埋組、肌肉勻漿注射組、皮下勻漿注射組空泡變性與細胞死亡所占面積比較低(P<0.05)。皮下顆粒包埋、肌肉勻漿注射、皮下勻漿注射三種方式優于肌肉顆粒包埋。肌肉顆粒包埋組、皮下顆粒包埋組、肌肉勻漿注射組、皮下勻漿注射組移植的甲狀旁腺細胞空泡變性與細胞死亡所占面積比在術后第1周較對照組高(P<0.05),術后第3周與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)?？梢?種移植方法都是安全有效的。

本實驗也有一定的局限性。由于研究條件的限制,樣本量較少,并且我們沒有測量家兔術前、術后外周血PTH及血鈣的變化,無法進一步驗證血PTH及血鈣的變化規律與移植的甲狀旁腺細胞的組織學形態是否相吻合。

綜上,從組織學上看,4種甲狀旁腺即時自體移植方法都是有效的,其中皮下顆粒包埋、肌肉勻漿注射、皮下勻漿注射3種方式優于肌肉顆粒包埋。最耗時的移植方法是皮下勻漿注射法。顆粒制作比勻漿制作更加快捷。