抗菌肽對于病原微生物的抗菌及耐藥機制

王撼宇，孫曉仲，雷志鵬，陳 歡，王 剛，張斯童，陳 光，孫 旸*

（1.吉林農業大學 生命科學學院 秸稈生物學與利用教育部重點實驗室，吉林 長春 130118；2.吉林省產品質量監督檢驗院，吉林 長春 130118）

微生物感染致死已經可以影響全球死亡的趨勢?？股氐某霈F則打破了這種趨勢，并給予了人們戰勝病原微生物的希望。雖然抗生素曾經能夠治療生物體內絕大多數的感染，但使用抗生素后生物體內不斷產生的耐藥性會逐漸減弱抗生素的作用效果。在現代醫學治療中已經發現了人體內許多部位（如泌尿道、呼吸道等）的病原體會產生出對抗生素的耐藥性。所以說設計出比傳統抗生素更不易受進化抗性機制影響的抗菌藥物是一個新的挑戰?？咕模╝ntimicrobial peptides，AMPs）是生物在長期進化過程中為適應環境、求得生存而最早產生的免疫活性分子，是天然免疫的重要介質，在宿主對抗病原入侵的免疫防御中起著極其重要的作用，被形象地稱為“天然抗菌劑”?？咕脑隗w內除了能以直接殺死病原菌的方式起作用外，更多的時候是作為免疫效應分子來啟動、調節宿主免疫防御體系。它們的工作原理是破壞細胞膜，調節免疫反應，減緩炎癥。由于它們引起抗藥性的可能性相對較低，因此一直認為AMPs是常規抗生素的潛在替代品。因此，AMPs成為國內外研究和開發的熱點，具有著廣闊的開發應用前景。本文對抗菌肽殺滅細菌作用機理及病原微生物耐受抗菌肽的基本原理進行綜述，旨在深入了解AMPs的抗菌機制和微生物對其耐藥機制，將為AMPs進一步開發與利用提供理論基礎。

1 抗生素的發展史

目前可能存在一個誤解，誤認為人類最早接觸抗生素的時間在20世紀初，但其實際接觸的時間要遠遠早于這個時間。早在古埃及、中國、希臘和羅馬中都有記載使用抗生素來治療細菌感染的記錄，當時使用發霉的面包對感染的患者進行治療[1]。在古蘇丹努比亞人（公元350-550年）和古埃及人的骨骼遺骸中發現了與現代抗生素有關的四環素結構物質等[2-4]。因此從這些證據可以看出，人類接觸并使用抗生素要比認知的時間早得多。

GERHARD DOMAGK于1935年介紹了第一個廣泛使用的抗生素，即磺胺嘧啶，在多種傳染性疾病中均具有抗菌活性。隨后發現偶氮磺胺是合成對氨基苯磺胺的前體，并且還沒有申請相對應的專利，這才導致了后續其衍生物以及磺酰胺類抗生素的時代的到來[5]。青霉素是最著名的抗生素之一，于1928年由亞歷山大·弗萊明發現，在第二次世界大戰期間開始大規模生產以及使用，隨后霍華德·弗洛里和歐內斯特·鏈進行了合成和純化[2，6]。1944年，塞爾曼·瓦克斯曼從灰鏈霉菌中發現了一種氨基糖苷類抗生素，并將其命名為鏈霉素[7-8]，因此他被稱為是“抗生素之父”，這標志著抗生素黃金時代的開始。在隨后的幾十年中，發現了20多種不同類型的抗生素，包括幾種不同的類型：磺酰胺，β-內酰胺類（青霉素、頭孢菌素），氨基糖苷類，喹諾酮類，環肽（包括短桿菌肽、多粘菌素、糖肽、脂肽和脂糖肽），四環素，大環內酯類（包括酮醇類），苯甲酚，硝基咪唑，二氫葉酸還原酶抑制劑，林沙酰胺等。自從抗生素首次出現以來，它已經改變了醫學的進程，并且拯救了全世界無數的生命。以前無法治療的傳染病及其災難性后果現在可以很容易控制。但是，耐藥性問題隨之也出現了。在1940年，青霉素還沒有開始大規模生產時候，就已經報道出了葡萄球菌對青霉素產生了耐藥性。在1958年，古霉素被報道出現了耐藥性。在那個抗生素生產的黃金時代，新型抗生素不斷被發現和開發用于臨床。但耐藥性的細菌以及真菌也在不斷的進化，因此，迫切需要具有替代作用模式的新型抗感染藥物來對抗不斷進化的耐藥性的細菌與真菌。AMPs被認為是傳統抗生素在某些治療用途上的可能替代品，它引起耐藥性[9]的可能性相對較小，因此有很大的應用和發展潛力。

2 抗菌肽介紹

AMPs是生物體內由特定基因編碼并通過誘導產生的，以一種非常重要的防御體系廣泛的存在與植物、動物以及微生物中。迄今為止，已發現許多不同AMPs，據報道，它們對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、感染性真菌均有抗菌活性，有時還具有對病毒、寄生蟲或瘧原蟲的抗菌抗活性[10-11]。其中許多還被證明通過激活免疫細胞來調節宿主免疫、炎癥或者抑制炎癥。為了強調其在高等生物中的多效性，天然AMPs通常被稱為“宿主防御肽”（host defense peptide，HDP），或者稱為“先天性防御調節肽（innate defense regulatory peptide，IDR）”。關于其免疫調節活性的報告大多在先天免疫水平上[12]。它們在所有真核生物（真菌、藻類、植物、無脊椎動物和脊椎動物）中含量豐富，分布在宿主防御感染前線的細胞和組織中（主要是循環免疫細胞和上皮細胞），證明了它們對先天免疫的影響和重要性?？刮⑸镫牡膶ｉT收集數據庫中（CAMPR3）目前包含8164個肽條目，一個特別豐富的來源是無尾物種，已經報告了近2 000個肽序列[13]。然而，AMPs在原核生物中也有很好的代表性，由革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌產生，其中一個豐富的類別就是細菌素[14]。AMPs是一種天然的低分子質量多聚肽，長度為9～100個氨基酸。盡管AMPs在結構和生化特性上具有高度的多樣性，但大多數AMPs都含有帶正電荷的氨基酸殘基、疏水或親水基序，這些決定了它們的水溶性且可以與帶負電荷的微生物細胞膜相互作用[15-19]。雖然抗菌肽的抗菌作用機制比較復雜，但許多抗菌肽通過與細胞質膜的結合和改變細胞膜的通透性來快速殺傷細胞或穿透細胞，抑制蛋白質合成、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）轉錄/復制、細胞壁生物合成或使基本酶活性失活。革蘭氏陽性細菌產生的AMPs具有特殊的抑制譜，并且已經應用在很多方面[20-25]。AMPs除了用于治療感染外，還可用于控制植物病害。天然AMPs的合成類似物已在轉基因植物中表達，以保護植物免受感染，或被微生物分泌，然后用作商業生物農藥的活性成分。重組或合成的AMPs可以安全地用于水產養殖的治療、牲畜的食品添加劑或食品防腐劑。

3 AMPs的抗菌機制

3.1 靶點結合

盡管已經證實了AMPs是通過讓細胞膜破裂來使細胞溶解，達到抗菌作用[26]（見圖1）。

圖1 抗菌肽對細胞膜的作用機制Fig.1 Mechanism of antimicrobial peptides on cell membrane

但隨后發現抗菌機制不只有這一種，在致病細菌中加入AMPs后所進行的分析中發現，有些AMPs并沒有改變致病細菌細胞膜的通透性，但卻仍然能夠起到了抗菌的效果，因此AMPs除了形成細胞膜孔隙之外，還與細胞內的肽作用靶點相結合[27-28]，且許多微生物即使在其膜受到廣泛損害后仍能存活，這表明不涉及膜溶解的其他機制可能也會導致細胞死亡[29]。需要注意的是，為了使AMPs和靶細胞內成分之間發生相互作用，肽需要通過易位過程被運輸到微生物中[30]。但這一過程的機制尚未明確，但推測細胞膜上的孔隙在AMPs的促進下，使得一些肽轉移到細胞內部，并將作用于細胞內靶點。AMPs進入到細胞內并與其靶點結合，起到抗菌的效果[31-32]。

3.2 干擾細胞壁的合成

羊毛硫抗生素是由革蘭氏陽性細菌產生的一類細菌素，其中有些AMPs作為酶抑制劑，主要干擾競爭性微生物的細胞壁合成。其機制是AMPs與脂質II結合，從而阻止合成細胞壁的前體—肽聚糖的聚合[33-34]。這種抑制作用也可能是由AMPs與細胞壁合成過程中的其他酶（如與肽聚糖易位有關的酶）結合引起的。一般來說，這是一種對抗革蘭氏陽性細菌更有效的方法，因為它們的細胞壁中含有大量的肽聚糖[35]。從植物和昆蟲中分離到了有效的抗真菌抗菌肽。ZENG H等[36]通過研究從阿克蘇芽孢桿菌中提取出來的TUBP1蛋白，發現破壞真菌細胞壁合成（由幾丁質組成）也是由一些以AMPs主導的機制。KLAUS K等[37]從甜菜（Beta vulgarisL.）中提取的IWF4是一種富含半胱氨酸和甘氨酸的30個氨基酸肽，顯示出一個具有幾丁質結合特性的結構域，能夠有效的抵抗真菌對于甜菜的破壞。FEHLBAUM P等[38]從果蠅昆蟲中分離出來的一種44氨基酸的抗真菌果蠅霉素。

3.3 其他機制

其他機制，如作用在細胞生長和增殖所必需的復制、轉錄和翻譯過程中，AMPs可以與DNA和RNA的結合，致使涉及這些核酸的合成過程受到抑制（見圖2）。

圖2 抗菌肽對細胞內的作用機制Fig.2 Mechanism of antimicrobial peptides in cells

如抑制主要的DNA復制酶，這已經是一種非常普遍的抗菌機制[39-40]。通過對CF-14肽抗菌作用觀察發現，其對DNA具有高度親和力，因此可以導致微生物功能的改變，達到抗菌效果[41]。通過對富含脯氨酸的抗菌肽觀察發現，其中含有其他配體，它們與主要熱休克蛋白特異結合，而與細菌伴侶無特異性結合。這些機制抑制了這些蛋白質的活性，從而破壞基本的細胞合成過程[42-43]。一些AMPs可能與真菌細胞膜上的受體結合，促進其插入細胞質，然后以非溶解方式誘導三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的丟失，這將會破壞細胞周期，導致對細胞有毒有害的活性氧的產生[44]，致使細胞死亡。

4 微生物對AMPs的耐藥機制

多年來，由于濫用和不加控制地使用抗菌物質導致了過去一些非常高效的抗生素和抗菌分子已經不能夠有效的抑菌抵抗，盡管這種現象是微生物進化的自然現象[45]，但這對人類抵抗致病微生物是一個非常大的挑戰。對于微生物來說，仍然有很多機制來應對抗生素和抗菌分子對其造成的威脅?？傮w來說，微生物應對AMPs的主要策略為：組成型抗性和誘導型抗性。組成型抗性，也稱為被動型抗性，表現出利用微生物機體固有的用來抵抗的機制（見圖2）。誘導或適應型抗性是為了響應AMPs的存在或其作用而觸發的機制[46]。

4.1 組成型抗性

組成型抗性的形成是由膜能量的改變和靜電屏蔽所形成的。膜能量的改變主要是堿性氨基酸向膜表面的移位，這將會導致其液體電荷發生變化。這樣一來，AMPs與膜的親和力降低，從而改變了它們的連接機制，這也是靜電屏蔽形成的結果，電荷變化主要是發生在革蘭氏陽性菌（外膜）中[47-48]。組成型抗性的一個例子是金黃色葡萄球菌中dlt操縱子的激活，dltA，dltB，dltC和dltD基因通過將堿性氨基酸D-丙氨酸轉運到膜的表面來影響菌壁磷壁酸的電荷，主要表現為電荷的減少。膜上電荷的這種變化降低了膜與AMPs的親和力，破壞了最開始形成的和隨后形成的的抗菌作用。在其他革蘭氏陽性細菌中也發現了類似的機制[49-50]。在革蘭氏陰性中，組成型抗性有兩個主要機理。其中一種抗性機制的形成是在外膜上的脂多糖類的脂質A形成靜電屏蔽來減少外膜凈負電荷來實現的[51-52]。另外一種抗性機制是因為脂質A之間的疏水相互作用增加，改變了膜的通透性，從而減少或完全阻止了AMPs的插入以及隨后形成的孔和分子的移位[53]。

圖3 微生物對抗菌肽的抗性機制Fig.3 Resistance mechanism of microbial to antimicrobial peptides

4.2 誘導型抗性

在誘導型抗性的機制中，主要是指蛋白酶和肽酶的流動、外排泵的激活以及靶點的突變修飾。第一種機制是指使用降解蛋白質和肽的酶來“殺死”威脅細胞活力的AMPs。這些酶可以被轉移到細胞外環境中起到作用，也可以作用于受到攻擊的細胞的細胞質中，降解轉位肽并阻止它們作用于細胞內靶點[54]。在這種情況下，外排泵被激活并開始工作，將轉運肽泵回到細胞外環境并保護細胞內部[55-56]。SHAFER W M等[57]在觀察淋病奈瑟菌在暴露于蛋白朊pro tegrin-1和人源抗菌肽LL-37之后，這種外排泵激活才被發現。SIEPRAWSKA-LUPA M等[58]研究發現，人源抗菌肽LL-37會被金黃色葡萄球菌溶血素蛋白酶所滅活。最后，靶點的突變修飾是需要更詳細地闡明的機制，它被認為是基于細胞膜和胞內AMPs靶點的瞬時突變，以減少甚至阻止肽與其受體的結合[59-60]。如VISSER L G等[61]研究發現，病原體小腸結腸炎耶爾森氏菌會改變外膜蛋白的產生，以防止AMPs相互作用。NURI R等[62]研究發現，細胞內部吞噬作用的發生會受到細胞外信號（如pH和鹽濃度變化，例如鎂和鈣）的調節影響。

5 AMPs的應用前景展望

目前，AMPs在人類和動物健康以及食品工業中的應用越來越多，人們逐漸的在尋找傳統合成化學品的替代品，因為這些傳統的化學品已經失去了有效性或消費者的可接受性。

據報道，MARTINEZ M等[63]通過人工設計并合成的陽離子抗菌肽P5通過增加質膜的通透性來抑制耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌（該耐藥微生物是引起醫院感染的主要病原體之一），此外，P5肽還能抑制生物膜產生的能力，這是為了應對出現的持續和反復的污染。類似的研究表明，BUONOCORE F等[64]從南極冰魚中提取出的氯霉素m3a肽對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腸球菌屬（與抗生素耐藥感染相關的重要病原體）都具有很好的抗菌效果。這些研究證明了AMPs在治療中的巨大潛力。

盡管已經研究了AMPs的幾種功能，但是由于缺乏對其觀察和使用可行模式的研究，其應用仍然受到限制。很少有AMPs被批準用于臨床用途，MARGIT M等[65]研究發現，多粘菌素B可以用于治療具有多重耐藥性的革蘭氏陰性細菌感染。大多數研究集中在AMPs的使用，如包裝和醫院用品。例如，與標準衛生技術相比，RIORDAN L等[66]在醫院使用的金屬表面加入了合成的人類抗生素，可有效降低微生物數量，減少耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、腸球菌和銅綠假單胞菌的數量。對于AMPs的生物活性改性包裝，這不僅是將其高科技的應用還具有潛在的消費市場。研究表明，與直接在食品中施用相比，乳鏈菌肽在包裝中的應用具有優越性，可降低生產成本并改善抗菌作用。IMRAN M等[67]將乳鏈菌肽Z（nisin Z）制成生物可降解薄膜，SOTO K M等[68]將Nisin制成電紡纖維，BARBOSA A A T等[69]所研制的乳鏈菌素纖維素膜，這些在運用于食品包裝時，能夠有效的減少與食物中毒和/或腐敗相關的李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸膜明串珠菌、金黃色葡萄球菌、酸熱脂環酸桿菌和蠟狀芽孢桿菌的數量。其他幾種多肽也在被研究應用在食品工業中，如SHWAIKI L N等[70]通過人工合成肽Dip KK-14和KK-14 R10能夠良好的抵抗食物之中的食品腐敗菌，然而對于其的包裝應用在食品工業還需要進一步研究。

考慮到當前對傳統消毒和治療物質的抗性問題，AMPs的使用已成為將來控制病原體的主要替代方法之一。AMPs的副作用小，同時對于耐藥性細菌能夠產生出很好的抑菌效果，這些特點表明著AMPs和抗生素在未來可以進行相互結合，應用于治療多種耐藥性的細菌病癥，從而降低藥物對人體產生的毒性。同時AMPs同樣也可在人體內進行作用，因為其可以發揮人體內部免疫調節的作用，刺激血管的生成，促進損傷的修復，代表著AMPs未來可以作為醫療產品從而更加方便且安全的調節人體內部的免疫系統。因此，該領域的研究需要不斷增加，對AMPs的功能分子原理的深入了解將使研究人員能夠更好地設計該領域的項目，防止浪費人力和財力并掌握成果。

6 結束語

深入了解AMPs的抗菌機制對于成功應用具有重要意義。在AMPs的抗菌機制上了解與微生物對AMPs耐藥性機制，對其從宏觀到微觀方面充分的理解，可以使研究人員開發出更好的方法來探索和評估AMPs的潛力。了解AMPs對病原微生物的抗菌以及病原微生物對抗菌肽的耐藥機制，有助于研究開發出更加完備的AMPs。目前，對AMPs的合成研究較多，隨著對其機理的進一步了解，對這些工程肽的優化迫在眉睫。盡管大多數AMPs抗性機制尚未得到證實和/或充分闡明，但新的研究和技術可以對其探究。需要注意的是，現在許多AMPs分子之間起共同作用，并且還有一些其他互補因素會影響抗菌作用。對AMPs研究中，不同肽之間協同作用的出現是一個日益突出的話題，并且也顯示出巨大的研究潛力。最后需要強調的是有時候AMPs作用和抗性的分子機制卻被多次忽略，因此需要進行基礎研究以闡明AMP的作用基礎機制，以避免資源浪費和優化適用結果。