威寧豆醬純種發酵工藝優化及揮發性風味物質分析

蒲 靜，宮沛文，楊瀟垚，孟淑真，包峻州，張問平，吳擁軍

（貴州大學 生命科學學院 農業生物工程研究院 山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室山地生態與農業生物工程協同創新中心，貴州 貴陽 550025）

豆醬又稱黃豆醬、黃醬或大豆醬，是大豆自然發酵而成的固態發酵調味品[1-2]。豆醬具有多種產品如豆面醬、豆瓣醬及黃豆醬等[3]，其作為中國特色的傳統調味品，能提供豐富的營養物質（蛋白質、脂肪、維生素及微量元素）[4-5]及不飽和脂肪酸（亞油酸、亞麻酸等），還可降低人群患心血管疾病幾率[6]。此外，豆醬中還含有多酚、大豆皂苷、類黑精、異黃酮等多種對人體有益的生理活性物質[7-11]，具有很好的保健功能。因此，豆醬不僅能使菜品呈現出更鮮美的滋味，增加菜品的營養價值，還具有很好的保健功能。

威寧豆醬主要由大豆自然發酵獲得，因其具有獨特風味深受人們的喜愛。然而，威寧豆醬目前多以家庭作坊式傳統自然發酵生產為主，衛生條件較差、生產周期長、質量不穩定、產量不高、季節性較強，因此，較低地工業化生產水平不能滿足市場的需要，食品安全也存在隱患[12]。為能提高豆醬食用安全性、縮短生產周期[13]，并能全年生產，可以通過人工接種純種發酵豆醬的方式進行生產，但目前市場上適用于威寧豆醬純種發酵的工業菌株種類較少，而且制作出的豆醬風味單一[14]，品質難以達到傳統生產方式生產出的豆醬。因此，優質純種豆醬發酵菌株的選取及后續工藝條件的優化是目前豆醬發酵中亟待解決的問題。

本研究前期從威寧地區醬曲樣本中分離篩選出具有優良發酵性能的菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DX-9和異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）DZ-3[12]，采用該菌株分別純種發酵大豆制作威寧豆醬，并以氨基酸態氮含量與感官評價為評價指標，優化制曲條件、輔料（食鹽、辣椒粉、五香粉）添加量與后發酵條件。最后，采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀對自然發酵豆醬和純種發酵威寧豆醬成品中的揮發性風味物質進行分析，為縮短威寧豆醬的生產周期、提高豆醬食用安全性以及促進威寧豆醬工業化生產提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

黃豆、食鹽、五香粉：市售；辣椒粉：自制；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DX-9（NC 000964）和異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）DZ-3（KY 105887.1）：本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

氯化鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；36%甲醛溶液（分析純）：重慶江川化工（集團）有限公司；結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（純度99.9%）：長沙三行生物科技有限公司；三糖鐵瓊脂（生化試劑）：青島海博生物公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

LB培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：參照文獻[15]配制；煌綠乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯培養基、沙門氏菌顯色培養基：青島海博生物公司；賴氨酸脫羧酶試驗培養基：上海賓穗生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD標準型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；800Y多功能粉碎機：武義海納電器有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋：英國阿斯太歐公司；SHZ-82恒溫水浴鍋：中國金壇市醫療儀器廠；DNP-9082電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；JE203多功能電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；HP6890/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫公司；57333-U手動固相微萃取裝置：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 威寧豆醬制作工藝流程及操作要點

操作要點：

挑選：挑選無蟲蝕、無霉變、新鮮優質的非轉基因黃豆。

烘烤：將黃豆置于140 ℃烘箱中烘1.5 h。

磨粉：采用多功能粉碎機磨粉，黃豆粉過60目篩。

高壓滅菌：121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至30℃備用。

混勻：按無菌水∶黃豆粉=4∶5（mL∶g）的比例混勻得到黃豆勻漿。

人工接種：將菌株DX-9、DZ-3分別接種到5 mL LB、PDA液體培養基中，分別于38 ℃、30 ℃，180 r/min條件下活化培養12 h。將活化后的菌液分別按1%（V/V）的接種量接種于30 ℃黃豆勻漿中。

制曲：將接種DX-9的黃豆勻漿于37 ℃恒溫發酵15 d，接種DZ-3的黃豆勻漿于28 ℃恒溫發酵15 d。

添加輔料：醬曲粉碎后加入10%食鹽、5%辣椒粉、1%五香粉，按醬曲∶無菌水=5∶3（g∶mL）混勻。

后發酵：將接種了DX-9與DZ-3的樣品分別置于37 ℃、28 ℃的恒溫水浴鍋中后發酵3個月[16]，即得威寧豆醬成品。

自然發酵威寧豆醬中不接種菌株，裝壇后置于室外進行日曬夜露的開放式發酵，定期攪拌，發酵時間為半年左右[17]。

1.3.2 制曲條件優化

以醬曲中的氨基酸態氮含量為評價指標，設置制曲溫度（DX-9制曲溫度為34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃，DZ-3制曲溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃）、菌株接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%，V/V）、制曲時間（3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d）為自變量，確定最優制曲溫度、菌株接種量、制曲時間。

1.3.3 輔料添加量的優化

（1）單因素試驗

以DX-9發酵豆醬的感官評分為考察指標，分別設置食鹽添加量（8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%）、辣椒粉添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、五香粉添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）為單因素自變量，考察食鹽添加量、辣椒添加量、五香粉添加量對DX-9發酵豆醬感官評分的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗基礎上，以DX-9發酵豆醬感官評分為評價指標，分別選取食鹽（A）、辣椒（B）、五香粉（C）添加量為考察因素設計正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 輔料添加量優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal tests for auxiliary material addition optimization

1.3.4 后發酵條件優化

通過前期的實驗確定制曲條件和輔料添加量后，以DX-9和DZ-3發酵豆醬的氨基酸態氮含量為評價指標，設置后發酵溫度（DX-9后發酵溫度為34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃，DZ-3后發酵溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃）、后發酵時間（15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d）為自變量，確定最優后發酵溫度、后發酵時間。

1.3.5 氨基酸態氮含量的測定

按國標GB/T 24399—2009《黃豆醬》[18]中的甲醛法測定氨基酸態氮含量。

1.3.6 威寧豆醬的感官評價

威寧豆醬的感官評分標準見表2[19-20]，滿分為100分。

表2 威寧豆醬的感官評分標準Table2 Sensory evaluation standards of Weining soybean paste

1.3.7 威寧豆醬微生物指標的測定

大腸菌群的測定：采用國標GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》中的平板計數法[21]；沙門氏菌的測定：采用國標GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》檢驗方法[22]；金黃色葡萄球菌的測定：采用國標GB 4789.10—2016《食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》中平板計數法[23]。

1.3.8 威寧豆醬中揮發性物質的檢測與分析

采用GC-MS法測定自然發酵豆醬和純種發酵豆醬的揮發性物質[24-25]，對總離子流色譜圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對美國國家標準與技術研究院14和Wiley275標準質譜圖，確定揮發性化學成分，采用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對含量。

1.3.9 數據處理

采用SPSS25.0對揮發性物質進行主成分分析（principal component analysis，PCA），確定主要揮發性物質[26]。使用Excel2016和SPSS25.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 制曲條件優化結果

2.1.1 制曲溫度

菌株DX-9和DZ-3制曲溫度對醬曲氨基酸態氮含量的影響見圖1。由圖1可知，隨著制曲溫度的逐漸升高，氨基酸態氮含量均呈先增后降的趨勢，分析原因可能是在各自的菌種最適生長溫度下，菌株生長情況最佳，分泌的蛋白酶也最多，對大豆蛋白質的分解作用最強，因此氨基酸態氮含量也最高，溫度升高或降低都會影響菌株的生長[27]。其中，菌株DX-9的最佳制曲溫度為38 ℃，菌株DZ-3最佳制曲溫度為34 ℃，在此溫度下，醬曲中氨基酸態氮含量分別為0.25 g/100 g、0.17 g/100 g。

圖1 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）制曲溫度對氨基酸態氮含量的影響Fig.1 Effect of koji-making temperature of strains DX-9 (A) and DZ-3(B) on amino acid nitrogen contents

2.1.2 菌液接種量

菌株DX-9和DZ-3接種量對醬曲中氨基酸態氮含量的影響見圖2。由圖2可知，氨基酸態氮的含量隨著接種量的增加而增加，當菌種添加量偏低時，豆曲生長緩慢，曲香變淡，隨著接種量增加，豆曲生長速率加快，消耗的水分增多。當二者接種量分別大于2%和3%時，醬曲發黏變黑，品質變差，影響翻曲[28]。因此，確定DX-9和DZ-3的最佳接種量分別為2%和3%。

圖2 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）接種量對氨基酸態氮含量的影響Fig.2 Effect of strains DX-9 (A) and DZ-3 (B) inoculum on amino acid nitrogen contents

2.1.3 制曲時間

菌株DX-9和DZ-3制曲時間對醬曲中氨基酸態氮含量的影響見圖3。

圖3 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）制曲時間對氨基酸態氮含量的影響Fig.3 Effect of koji-making time of strains DX-9 (A) and DZ-3 (B) on amino acid nitrogen contents

由圖3可知，當菌株DX-9發酵時間≤12 d、菌株DZ-3發酵時間≤18 d時，氨基酸態氮含量均隨著發酵時間的延長呈上升趨勢，醬曲顏色、質地均勻。繼續發酵則表面產生了大量孢子，菌株生長消耗了醬曲大量水分，醬曲開始發黑、結塊[29]。因此，確定DX-9、DZ-3的最優制曲時間為12 d、18 d，此時氨基酸態氮含量分別為0.21 g/100 g、0.19 g/100 g。

2.2 輔料添加量優化結果

2.2.1 單因素試驗

自然發酵和菌株DX-9發酵豆醬均為褐色，菌株DZ-3發酵豆醬為紅褐色。制曲階段中菌株DX-9比DZ-3周期短6 d，并且氨基酸態氮含量比菌株DZ-3高。因此，選擇菌株DX-9為發酵菌株進行輔料添加量的優化。食鹽、五香粉和辣椒粉添加量對菌株DX-9發酵豆醬的感官評分的影響見圖4。

圖4 食鹽（A）、五香粉（B）及辣椒粉（C）添加量對豆醬感官評分的影響Fig.4 Effect of salt (A),five-spice (B) and chili power (C) addition on sensory evaluation of soybean paste

由圖4可知，隨著食鹽、五香粉及辣椒粉添加量的增加，菌株DX-9發酵豆醬的感官評分均呈先升高后下降的趨勢，當食鹽、五香粉及辣椒粉添加量分別為10%、1%、5%時，豆醬的感官評分均最高，分別為79分、80分、78分。因此，確定食鹽、五香粉及辣椒粉的最佳添加量分別為10%、1%、5%。

2.2.2 正交試驗結果與分析

輔料添加量優化正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 輔料添加量優化正交試驗結果與分析Table3 Results and analysis of orthogonal tests for auxiliary material addition optimization

表4 正交試驗結果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3及表4可知，食鹽添加量（A）對豆醬感官評分影響最大（P＜0.05），其次為五香粉添加量（C），辣椒粉添加量（B）影響最小。優化的條件組合為A2B2C3，即食鹽添加量為10%，辣椒粉添加量為5%，五香粉添加量為1.5%，此條件下豆醬感官評分最高，為87分。

2.3 后發酵條件優化結果

2.3.1 后發酵溫度

菌株DX-9和DZ-3后發酵溫度對豆醬中氨基酸態氮含量的影響見圖5。由圖5可知，氨基酸態氮含量均隨著后發酵溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，當菌株DX-9和DZ-3的后酵溫度分別為40 ℃、36 ℃時，氨基酸態氮含量最高，分別為0.66 g/100 g、0.55 g/100 g。因此，確定菌株DX-9和DZ-3的最佳后發酵溫度分別為40 ℃和36 ℃。

圖5 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）后發酵溫度對氨基酸態氮含量的影響Fig.5 Effect of post-fermentation temperature of strains DX-9 (A) andDZ-3 (B) on amino acid nitrogen contents

2.3.2 后發酵時間

菌株DX-9和DZ-3后發酵時間對豆醬中氨基酸態氮含量的影響見圖6。

圖6 菌株DX-9（A）和DZ-3（B）后發酵時間對氨基酸態氮含量的影響Fig.6 Effect of post-fermentation time of strains DX-9 (A) and DZ-3(B) on amino acid nitrogen contents

由圖6可知，菌株DX-9和DZ-3的后發酵時間為30 d時，豆醬中氨基酸態氮含量分別為0.68 g/100 g、0.50 g/100 g，均達到國標GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求（氨基酸態氮含量≥0.5 g/100 g）。結合感官評價，當后發酵時間為30 d時，菌株DX-9和DZ-3發酵的豆醬色澤較淺、醬味不足、均勻度不夠。發酵至90 d時，菌種DX-9發酵的豆醬為褐色，菌種DZ-3發酵的豆醬為紅褐色，醬香味均濃郁，酯香氣均足，濃稠均適度。因此，確定菌株DX-9和DZ-3的最佳后發酵時間均為90 d。

2.4 威寧豆醬的感官評價

對自然發酵、菌株DX-9和DZ-3發酵的豆醬成品進行感官評價，結果見表5。由表5可知，色澤上，菌株DX-9和自然發酵的豆醬為褐色，菌株DZ-3發酵的豆醬為紅褐色；在氣味上，自然發酵醬香濃郁，純種發酵豆醬兼具醬香和酯香；滋味上，3種豆醬味鮮醇厚、咸甜適口，但純種發酵豆醬更加細膩；形態上，純種發酵豆醬比自然發酵豆醬更粘稠，菌株DZ-3發酵豆醬相比DX-9發酵豆醬偏稀。綜合比較，菌株DX-9比菌株DZ-3發酵的豆醬品質更佳。

表5 不同豆醬成品的感官評價結果Table5 Sensory evaluation results of different soybean paste products

2.5 威寧豆醬微生物指標的測定結果

自然發酵、菌株DX-9及DZ-3發酵豆醬的微生物指標見表6。由表6可知，3種豆醬的微生物指標均符合國標GB 2718—2014《釀造醬》要求[20]。菌株DX-9和DZ-3發酵豆醬的大腸菌群數均小于自然發酵豆醬；菌株DX-9和DZ-3發酵豆醬均未檢測到金黃色葡萄球菌，自然發酵豆醬中金黃色葡萄球菌數量＜10 CFU/g；在3種豆醬成品中均未檢測到沙門氏菌。綜上可知，純種發酵安全性比自然發酵高。

表6 不同豆醬成品的微生物指標檢測結果Table6 Determination results of microbial indexes of different soybean paste products

2.6 威寧豆醬中揮發性風味物質的檢測結果

2.6.1 揮發性風味物質檢測結果

不同豆醬成品中揮發性物質的GC-MS分析結果見表7，韋恩圖見圖7。

圖7 不同豆醬成品揮發性物質的韋恩圖Fig.7 Venn diagram of volatile substances in different soybean paste products

表7 不同豆醬成品中揮發性物質的GC-MS分析結果Table7 GC-MS analysis results of volatile components in different soybean paste products

續表

續表

由表7可知，自然發酵豆醬、菌株DX-9發酵豆醬及菌株DZ-3發酵豆醬中揮發性風味物質分別共檢測到73種、50種、64種，3種豆醬中共有揮發性風味物質23種，主要揮發性物質種類為烴類、酯類、醇類、酮類、醛類、酸類，這與其他豆醬揮發性物質的研究結果一致[25，30]。其中自然發酵豆醬和菌株DZ-3發酵豆醬中有39種相同揮發物質，自然發酵豆醬和菌株DX-9發酵豆醬中有32種相同揮發物質。自然發酵豆醬的揮發性物質中醇類物質的相對含量較多，其中1-辛烯-3-醇的相對含量為12.645%；菌株DZ-9發酵威寧豆醬中的揮發性物質中酸類物質相對含量較多，如：2-甲基-丁酸（60.795%）、異丁酸（7.673%）、乙酸（7.210%）；菌株DZ-3發酵威寧豆醬中主要揮發性物質為烴類物質，如：雙戊烯（33.765%）、β-月桂烯（9.351%）、γ-萜品烯（6.784%）、α-萜品烯（3.682%）。本研究中菌株DX-9發酵豆醬中特有酚類物質的都有醬香風味，雖微量，但呈香作用明顯，這可能是菌株DX-9發酵豆醬比菌株DZ-3發酵豆醬感官評分高的主要原因。

2.6.2 揮發性風味物質主成分分析結果

威寧豆醬的風味由多種主要風味物質相互作用形成，選擇豆醬中6種含量較高的物質（醇類、酮類、酸類、酯類、醛類和烴類物質）作為主成分變量，以揮發性物質相對含量為標準，利用SPSS25.0進行主成分分析。揮發性物質主成分累積方差貢獻率見表8，以特征值＞1確定主成分個數，威寧豆醬中揮發性物質主成分個數為2。

表8 揮發性物質主成分累積方差貢獻率Table8 Cumulative variance contribution rate of principal components of volatile substances

揮發性物質主成分載荷距陣見表9。由表9可知，醛類、醇類、酮類、酯類4種物質在主成分1上載荷較高；烴類、酸類、酯類、酮類4種物質在主成分2上載荷較高。且由表8可知，主成分2的積累方差貢獻率比主成分1高，為100%，烴類和酸類物質相關系數在主成分2上絕對值最高。因此，確定威寧豆醬的主要揮發性物質為烴類和酸類物質。

表9 揮發性物質主成分載荷距陣Table9 Principal component loading matrix of volatile substances

3 結論

以自然發酵豆醬為對照，采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DX-9和異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）DZ-3分別發酵制備威寧豆醬，以氨基酸態氮含量和感官評分為評價指標，確定菌株DX-9、DZ-3的最佳制曲條件為：接種量2%和3%，制曲溫度38 ℃和34 ℃、制曲時間12 d和18 d；豆醬中輔料食鹽、辣椒、五香粉的最適添加量分別為10%、5%、1.5%；菌株DX-9、DZ-3的最佳后發酵條件為：溫度40 ℃和36 ℃、時間均為90 d。采用GC-MS對發酵豆醬中的揮發性風味物質進行分析，結果表明，自然發酵、菌株DX-9和DZ-3發酵豆醬中揮發性風味物質分別有73種、50種和64種，共有物質為23種。其中，自然發酵豆醬、菌株DX-9和DZ-3發酵豆醬中含量最多的物質分別為醇類（27.36%）、酸類（75.68%）和烴類（64.21%），通過主成分分析結果表明，威寧豆醬中主要揮發性風味物質為烴類和酸類。純種發酵豆醬的安全性均高于自然發酵豆醬，純種發酵豆醬中菌株DX-9比DZ-3發酵豆醬品質更佳，為最佳的威寧豆醬純種發酵菌株。本研究可為縮短威寧豆醬的生產周期、提高食用安全性、降低生產成本的目的，為威寧豆醬的工業化生產提供科學依據。