高通量測序技術及其在黃酒微生物多樣性研究中的應用

杜貞娜，程 斐，單之初，郭懷宇，孫劍秋 ，臧 威

（1.紹興文理學院 生命科學學院，浙江 紹興 312000；2.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312032）

黃酒是我國傳統的發酵酒精飲料[1-2]，酒精含量（4%vol～20%vol）較低，其富含營養物質，具有獨特風味，被譽為“液體蛋糕”[3-4]。我國黃酒的種類豐富，產品以江浙滬為中心，遍布全國[4-5]。各地黃酒以糯米、黍米、玉米、黑米等富含淀粉的谷物作為主要原料，以酒母、麥曲和酒藥等作為糖化發酵劑釀造而成[6]，釀造過程包括浸米、蒸飯、攤冷、落缸、發酵、壓榨、煎酒和貯存等諸多環節[7]。黃酒的釀造過程中，主要源于糖化發酵劑的釀酒微生物產生各種復雜的分解酶系，通過一系列的生物化學反應過程將原料中淀粉等大分子物質降解和轉化為乙醇和糖類、酯類、有機酸類、氨基酸類及其各種醇類物質等。黃酒釀造過程與其他傳統釀造食品一樣都屬于開放式發酵，環境中的微生物也參與發酵過程，與主要釀造微生物共同影響黃酒風味物質的形成[8-9]。因此，研究黃酒中的微生物多樣性對控制黃酒釀造工藝、提升黃酒品質具有重要意義。

黃酒中微生物群落結構的研究最早采用傳統的培養分離方法，基于菌株的生理生化特性與某種基因序列對釀酒微生物進行分類和鑒定，研究結果具有一定的局限性，LV X C等[10]對紅曲酒中酵母菌的研究結果表明，傳統微生物學方法不能檢測到所有的酵母菌株。隨著現代生物技術的發展，逐漸建立起來的變性凝膠梯度電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術[11-12]、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）[13]等分子生物學方法，使人們更深入了解參與黃酒釀造過程中的微生物種類，這對黃酒釀造微生物研究發揮了積極作用，但是在分析微生物群落結構組成時，以上技術也表現出準確率低、實驗條件要求高等缺點。目前，廣泛使用的第二代測序技術（second generation sequencing，SGS），又稱下一代測序技術（next generation sequencing，NGS）或深度測序（deep sequencing，DS）[14-15]，及第三代測序技術（third generation sequencing，TGS）能夠克服上述分子生物學技術的缺點，因其具有測序時間短、高通量、成本低、定量準等優點，日益發展成熟，廣泛運用于黃酒釀造微生物的研究[16-19]。本文綜述了高通量測序技術的發展階段，詳細介紹了該技術的原理、方法、操作流程及數據分析方法，以及高通量測序技術在黃酒微生物多樣性的研究中的應用，并對黃酒微生物多樣性的研究方向進行了展望，為全面認識黃酒微生物多樣性及相關機理，進一步深入開展黃酒微生物的深入研究提供參考依據。

1 高通量測序技術簡介

1.1 高通量測序技術的發展階段

早在20世紀70年代，美國生物化學家SANGER F發明的雙脫氧法測序技術（Sanger測序）是第一代測序技術，在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶合成DNA鏈的過程中加入雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP），得到一系列不同長短的DNA片段[20]，這成為當時DNA測序的主流技術。但是，Sanger測序法存在速度較慢、通量較低、成本較高等不足，已經不能滿足大規模測序所需的測序深度和測序效率等的要求[21]。

以高通量為特點的第二代測序技術是測序技術發展歷程的一個重要里程碑，可以在短時間內產生數以千計甚至百萬計的序列，這些序列有助于識別樣本中難以培養或不可培養的微生物，可以直接對微生物類群進行全貌的分析，為研究各種微生物和發現一些稀有甚至未知的物種提供了新的研究手段[18，22]，目前，下一代測序技術主要包括羅氏（Roche）公司的454焦磷酸測序平臺，Illumina公司的Solexa測序技術、ABI公司的SOLiD測序技術和Life Techologies公司的Ion Torrent測序技術。

大部分第二代測序技術也存在局限性，如無法準確全面的測序、依賴于PCR擴增、測序讀長較短及其易變異等，無法實現全基因組覆蓋。為了更加準確與高效解讀DNA序列信息，第三代測序技術已經建立，目前有HelicosBiosciences公司的真單分子測序（true single-molecule sequencing，tSMS）技術、Pacfic Biosciences公司的單分子實時（single molecule real-time，SMRT）測序技術、Oxford Nanopore公司的納米孔單分子測序技術（Oxford nanopore technologies，ONT）以及VisiGen Biotechnologies公司研發的熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）測序技術。

1.2 高通量測序技術原理及特點

（1）第二代測序技術

由于傳統的測序技術已經不能完全滿足各種生境內微生物多樣性研究的需要，第二代測序技術應運而生，由于具有測序結果的通量高、可定量、平行測序等優點而被廣泛運用于各領域研究中。2005年，羅氏公司（Roche）公司首先推出劃時代的新型高通量454焦磷酸測序技術，該技術采用焦磷酸合成測序法[23]，利用乳膠系統對DNA分子進行擴增，實現了大規模測序，測序特點為速度快、通量高以及讀長長等，可避免傳統測序需要進行的熒光標記以及跑膠等繁瑣步驟，但在2013年停止了454測序儀的使用。

隨后Illumina公司推出Solexa測序技術[21，24]，其原理為基于高密度的單分子陣列序列分析，核心技術為聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和可逆性終止化學反應，實現了邊合成邊測序。Solexa測序的步驟是：第一步將基因組DNA處理成100～200 bp片段，在兩端接上特定的DNA接頭后進行擴增，獲得單鏈DNA文庫；第二步將帶接頭的待測DNA片段加入芯片上與其表面的堿基產生互補雜交連接到芯片表面，這些小段的DNA分子經過延伸和橋式擴增后，在flow cell上形成了具有數以億計單分子簇（Clusters），第三步加入帶熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）進行邊合成邊測序，由于這些dNTP的3'末端被一個疊氮基堵住，所以每次反應只能添加一個dNTP，最后記錄熒光信號并進一步分析轉化為測序堿基信息?，F在Illumina公司主要測序平臺有Hiseq、MiSeq、NovaSeq 6000等，其優勢主要在于測序數據精準度最高可達99.9%，確保了高精確度和真實的單堿基連續測序，而且與其他二代測序平臺相比，測序成本也較低和運用領域多，但是序列讀長較短。

在以上兩種測序技術的基礎上，ABI公司在2007年推出基于酶連接法的新一代高通量SOLiD測序技術[25-26]，基本測序步驟是：第一步是獲得目標DNA小片段，兩端加上接頭，構建DNA文庫；第二步是乳液聚合酶鏈式反應（PCR）/微珠富集，與454焦磷酸測序類似，但是測序微珠只有1 μm；第三步為加入連接酶進行測序；第四步是數據分析，得到SOLiD原始序列。創新之處在于應用雙堿基編碼的方式獲取DNA序列信息，將每個堿基閱讀兩次，大大降低了測序帶來的錯誤率，提供了內在的校正功能。

2010年，Life Techologies公司利用半導體芯片技術成功設計出基于Ion Torrent的測序技術[27]，基于半導體的微pH計實現了快速地高通量測序。在這項測序技術中，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，按順序加入4種非修飾核苷酸中的一個，依據堿基互補配對原則合成互補DNA鏈，DNA鏈每延伸一個堿基，就會釋放一個質子（H+）而導致pH值改變，通過傳感器檢測，將化學信號轉變為數學信號，最終獲得DNA序列信息?；静襟E：首先構建基因文庫，在樣品DNA兩端加上標準接頭；然后進行油包水PCR，也叫乳濁液PCR，把文庫種到測序珠子上去并進行擴增；最后將上一步洗脫下來的珠子上機測序，通過測量并記錄pH值變化而測出DNA序列。該測序平臺的主要優勢，就是可以從很少量的起始DNA進行測序，測序速度快。

（2）第三代測序技術

第三代測序是以單分子測序技術為基礎，不依賴于PCR擴增，具有超長讀長和運行快等特點，主要用于突變鑒定（single nucleotide polymorphisms，SNP）檢測、基因組測序、甲基化研究等方面[28]。

tSMS平臺是由Helicos Biosciences公司推出的第一個商業化的單分子測序平臺，其基于光學信號的邊合成邊測序技術[29-30]。測序時首先進行樣品DNA處理，然后在3'末端加上polyA和使用Cy5熒光染料標，同時在末端進行阻斷；其次與玻璃芯片上的DNA模板polyT進行雜交并精確定位，之后加入被標記的堿基和DNA聚合酶的混合液，堿基自然延長；最后使用電荷耦合器件（coupled-charge device，CCD）攝像機在光學信號下讀取雜交模板信息。當標記解除后，加入新的標記的堿基和DNA聚合酶使反應繼續循環下去，從而確定堿基序列。由于采用Cy5熒光基團具有很好的光穩定性、高熒光效率和靈敏的監測系統等，可以讀取單個分子，在很大程度上提高了序列分析的精準度，但是這種測序技術也存在測序讀長短、輸出數據低、錯誤率高等不足。

Pacific Biosciences公司推出SMRT測序技術，是基于熒光標記的邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為載體進行測序反應[31-32]，核心技術是零模波導孔（zero-mode waveguides，ZMWs）技術，ZMWs是一種直徑為100 nm、厚度為70 nm的微小納米孔，此空間正好可容納一個DNA聚合酶分子，從而使得在此位置可觀察到合成DNA鏈過程。測序時將樣品DNA處理成小片段，以4種不同熒光標記的dNTP作為原料進行合成時，所連接的dNTP會因為反應而在ZMW納米孔底部短暫停留，在熒光收集設備則可以收集到配對dNTP的熒光信號，根據熒光的種類就可以判定dNTP的種類，從而實現測序。

納米孔單分子測序技術（ONT）采用“邊解鏈邊測序”的方法，其中核酸外切酶與α-溶血素納米孔相耦合是該測序平臺的核心，控制堿基穿過納米孔的速度是技術的關鍵；主要原理是將蛋白納米孔嵌入合成膜，浸在離子溶液中，膜的兩側施加恒定的電勢，使離子電流通過納米孔，由于不同堿基的帶電性質不同，通過檢測電流信號來確定堿基序列[33-34]。熒光共振能量轉移（FRET）測序技術是基于熒光共振能量轉移原理對樣本基因組進行測序[35]，基本步驟是先將被供體熒光基團標記的DNA聚合酶和DNA模板分子固定，摻入四種不同的熒光受體所標記的dNTP，根據堿基發出的熒光信號來判斷dNTP的類別以確定基因組信息。這項測序技術是利用電信號測序，處理樣品較簡單、成本較低等；可是由于DNA通過納米孔的速度很快，容易導致電流變化不明顯，從而降低了測序結果的準確性。

1.3 高通量測序技術的操作流程

高通量測序技術的主要操作流程，一般包括樣品準備、總DNA的提取、構建文庫、上機測序、原始數據預處理與質控、操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析、數據分析等步驟，高通量測序技術的基本操作流程見圖1。

圖1 高通量測序技術的基本操作流程Fig.1 Basic operation flow of high-throughput sequencing technology

1.4 高通量測序技術常用的數據分析方法

高通量測序產出的是原始reads數據，原始數據一般需要使用USEARCH或QIIME進行雙端合并、去標簽和引物、拼接質控操作，獲取樣品的代表序列信息，運用Vsearch進行聚類獲得OTUs或運用DADA2去噪獲得擴增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASVs）之后再進行統計分析。然后，可以通過量化每個樣本中特征序列的頻率來獲得特征表，即OTU或ASV表。接著，對特征序列進行分類，通常在界、門、綱、目、科、屬和種的層級上進行分類，從而為微生物群提供了更多級別的降維視角，其中OTUs和ASVs的獲取主要通過與已經建立的基因數據庫比對以獲得分類學注釋。目前，常用的基因數據庫有Greengenes[36]、SILVA[37]、UNITE[38]和GenBank[39]等。在多樣性分析中，普遍采用QIIME、Mothur等軟件對測序數據進行分析，主要包括相關性分析、聚類分析、物種種類、差異性分析和排序分析等。

2 高通量測序技術在黃酒微生物多樣性研究中的應用

2.1 糖化發酵劑對黃酒微生物多樣性的影響

在黃酒釀造過程中，酒曲內的微生物主要發揮糖化功能，利用釀酒原料中的營養物質進行繁殖和代謝，將淀粉分解為葡萄糖及其他碳水化合物，供酵母菌發酵利用而產生酒精，并為黃酒的釀造提供各種酶類、有機酸、多肽類、氨基酸等物質，影響黃酒獨特的色、香、味特征[40]，對黃酒品質產生重要影響[41-42]。

2.1.1 酒藥

酒藥以秈米粉和辣蓼草等作為主要原料，接種陳藥后在適宜條件下進行培養而獲得的黃酒釀造用糖化發酵劑，在黃酒釀造過程中起到重要作用[43-44]。臧威等[43]基于傳統的分離培養方法對紹興黃酒酒藥中酵母菌的物種資源進行研究，扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）占有絕對的分布優勢，表明扣囊復膜孢酵母對紹興黃酒酒藥的生產性能來說至關重要。CHEN C等[9]利用Illumina MiSeq高通量測序技術揭示了酒藥微生物的多樣性對紹興酒發酵過程中發酵特性與揮發性成分的影響，結果表明，酒藥中主要的微生物群落為片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏屬（Weissella）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和根霉屬（Rhizopus），糖化力與片球菌屬、酵母屬和根霉屬的存在呈顯著正相關，而產酸能力與片球菌屬、魏斯氏屬和根霉屬密切相關，產酒精能力與片球菌屬和根霉屬呈正相關，這些微生物對紹興酒的發酵活性和風味特征有重要影響。

2.1.2 麥曲

我國黃酒生產用曲的種類多種多樣，其中使用最為廣泛的是麥曲[45]。麥曲是以小麥作為主要原料，經過粉碎、加水、拌和、成型、堆放，在合適的溫度、濕度條件下培養制作而成[44]。制曲過程是開放的，所形成的麥曲微生物群落極其復雜[46]，麥曲微生物主要包括絲狀真菌、細菌和酵母菌。

JI Z等[47]利用高通量測序技術對上海、浙江和江蘇的黃酒麥曲進行分析，紹興黃酒生麥曲、江蘇黃酒生麥曲、上海黃酒生麥曲、接種黃曲霉（Aspergillus flavus）的熟麥曲和天然的熟麥曲在真菌屬水平上，真菌的多樣性依次下降，曲霉屬（Aspergillus）是優勢絲狀真菌。細菌在黃酒釀造過程中也同樣扮演著重要角色，劉蕓雅等[48]采用Illumina技術對紹興黃酒麥曲中細菌16S rDNA可變區序列進行測序，在屬水平上的主要優勢菌包括糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸桿菌屬（Enterobacter），而且芽孢桿菌屬（Bacillus）和糖多孢菌屬表現出突出的分布優勢。XIE G F等[17]對麥曲中細菌群落結構進行了基于Illumina技術的高通量測序分析，結果發現第5天麥曲樣品中放線菌門（Actinobacteria）的細菌相對豐度達到了87%，其中糖多孢菌屬為優勢菌屬，第30天麥曲樣品放線菌門的相對豐度顯著下降到40.7%，而糖多孢菌屬的相對豐度大幅度下降到8%，芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬的相對豐度分別增加至14.5%和11.6%，根據麥曲中細菌群落結構的顯著性變化可以推測不同種類的細菌在麥曲中發揮的作用。

2.2 釀造環節對黃酒微生物多樣性的影響

2.2.1 浸米

在黃酒釀造前期，浸米是開始正式發酵之前的關鍵步驟。浸米不僅能夠使原料米吸水膨脹便于蒸煮，而且漿水中存在的微生物可以使漿水酸化，抑制雜菌生長繁殖，對于后續的黃酒發酵過程和風味物質形成都可以發揮積極作用[1，6，49]。姬中偉等[50]對不同原料的米漿水進行研究，發現米漿水中的微生物主要是乳酸菌，糯米漿水酸度明顯高于其他原料，觀察米漿水的酸度變化對于黃酒生產的發酵控制具有指標性意義。朱小芳等[51]利用Illumina MiSeq高通量測序技術全面分析了米漿水中的細菌群落結構，發現乳桿菌屬（Lactobacillus）為米漿水中主要細菌類群，豐度占比為60.7%，其中57.4%的菌群為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），21.1%的菌群為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），另外漿水中也分布有片球菌屬、醋酸菌屬（Acetobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）等細菌類群。

2.2.2 發酵

發酵是黃酒釀造的重要工序，蒸好的米飯與麥曲、淋飯酒母在陶缸內攪拌混勻，經過3～5 d完成前發酵過程，然后將發酵醪液轉入陶壇進行后發酵，發酵周期歷時3個月。在發酵醪液內復雜微生物區系的作用下，完成淀粉轉化、酒精形成和風味物質產生等重要的生物轉化過程[44]。黃酒發酵是系列微生物共同參與的生產過程，包括細菌、霉菌、酵母菌等各種微生物類群[47]。在落缸發酵后，醪液內酵母菌很快發酵產生酒精，隨著黃酒發酵在較低的pH下持續進行，發酵醪液處于高酒精和高酸環境，限制了其他雜菌生長，導致大量微生物豐度減少或消失[52]。因為黃酒發酵是微生物作用的結果，任何影響微生物菌群結構變化的因素都會對黃酒的最終品質產生影響，對黃酒發酵過程中微生物多樣性的變化研究分析，對指導黃酒生產具有一定意義[53]。

WANG P X等[52]利用454焦磷酸測序技術對紹興黃酒釀造過程中的細菌多樣性進行分析，結果發現處于黃酒不同發酵階段的細菌群落結構和多樣性存在顯著差異，發酵醪液中存在10多個細菌屬，其中乳桿菌屬和芽孢桿菌屬為優勢微生物種群，在黃酒風味形成中可能起著重要作用。LIU S P等[5]通過MiSeq焦磷酸測序方法研究紹興黃酒發酵過程中細菌演替規律，發現紹興黃酒發酵過程中有10個優勢細菌屬，包括芽孢桿菌屬、亮葡菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬、魏斯氏屬、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、糖多孢菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬和乳桿菌屬，其中芽孢桿菌屬和乳酸菌屬在黃酒發酵細菌中起主導作用。JI Z等[47]通過Illumina-Miseq高通量測序技術解析黃酒發酵過程中真菌微生物的變化，發現在屬的水平上，各個發酵階段的醪液中優勢菌是曲霉屬，表明絲狀真菌的代謝產物可能對黃酒中主要化學物質的形成有重要貢獻。隨著發酵的繼續進行，物種豐富度逐漸降低，這可能是由于氧氣和營養成分的改變，在不同的黃酒發酵階段中釀酒微生物可以產生不同的有機酸的原因。

3 展望

高通量測序技術方法簡單、通量更高、成本較低和速度較快，在黃酒釀造微生物研究中具有重要應用價值，不僅可以闡釋黃酒發酵過程中微生物多樣性，而且可以檢測釀造微生物菌群的動態變化，彌補了傳統培養方法的不足。由于第三代測序技術成本較高、準確率低，第二代測序技術仍然為黃酒釀造微生物研究的主流技術。但是，目前利用二代測序技術對黃酒微生物群落結構進行分析，一般只能注釋到屬水平或者更高的分類階元而不能準確注釋到種水平，難以徹底解析微生物種類結構及其釀造微生物種類與黃酒中成份物質的代謝關系。在未來的黃酒微生物研究中，高通量測序技術與宏基因組學、轉錄組學相結合，可以更加深入的研究黃酒釀造微生物的生物學功能與群落結構，也為進一步開展優良釀造菌種的篩選和改良、關鍵微生物代謝產物對黃酒品質的影響等科研課題提供了新的研究手段。