UFLC法同時測定梔子厚樸湯中2個黃酮類成分的含量

桑 野，王開鼎，李海鵬，馮 波，關 皎，朱鶴云 (吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

梔子厚樸湯出自《傷寒論》，由梔子、厚樸、枳實三味藥材組成，具有清熱除煩、寬中消滿的功效[1]。梔子厚樸湯中的化學成分主要包括環烯醚萜類、木脂素類、黃酮類、生物堿類、揮發油類等，具有抗抑郁、抗炎、抗焦慮、增加冠狀動脈血流量、保肝利膽等多種生物活性，臨床用于抑郁癥、焦慮癥、失眠癥、傳染性肝炎、膽囊炎等疾病的預防與治療[2]。其中，柚皮苷和新橙皮苷是梔子厚樸湯組成藥材枳實中含有的2個代表性黃酮類成分。藥理學研究表明，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗骨質疏松等作用[3-4]，新橙皮苷具有抗抑郁、降低血糖和血脂等作用[5-6]。近年來，超快速液相色譜(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)技術，相比于常規的高效液相色譜分析技術，具有分離度好、分析速度快、靈敏度高等優點，廣泛應用于中藥質量控制研究[7-8]。本研究采用UFLC技術同時測定梔子厚樸湯中的柚皮苷和新橙皮苷的含量，為梔子厚樸湯的質量控制和新藥開發提供參考。

1 儀器與試藥

超快速液相色譜儀(Prominence)：日本島津公司；冷凍干燥機(Scientz-12SN)：寧波新芝生物科技股份有限公司；臺式高速冷凍離心機(TG16KR)：長沙東旺實驗儀器有限公司；快速混勻器(XK96-A)：江蘇新康醫療器械有限公司；數控聲波清洗器(KQ-250DE)：昆山市超聲儀器有限公司；數字控溫電熱套(98-1-C)：天津泰斯特儀器有限公司；旋轉蒸發儀(R-3HB)：瑞士布琪公司；電子天平(CPA 225D)：德國賽多利斯儀器有限公司。

HPLC級乙腈：美國Fisher科技；HPLC級甲醇：美國Fisher科技；HPLC級甲酸：國藥集團化學試劑有限公司；屈臣氏純凈水：屈臣氏集團有限公司；柚皮苷對照品(純度>98%，批號：110722-201815)：中國食品藥品檢定研究院；新橙皮苷對照品(純度>98%，批號：111857-201804)：中國食品藥品檢定研究院。

梔子(產地：江西)、厚樸(產地：四川)和枳實(產地：湖南)藥材購自吉林市吉林大藥房。

2 方法與結果

2.1 樣品制備方法及提取條件的選擇

2.1.1 對照品溶液的制備

取柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成質量濃度分別為0.3 g/L和0.1 g/L的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液制備方法的優化與確定

首先對梔子厚樸湯凍干粉末的處理方法進行了考察，分別采用50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇考察凍干粉樣品中2個黃酮類成分的提取率，結果100%甲醇提取效果最佳。其次，考察了不同超聲時間對提取效果的影響。實驗中對比了超聲提取20、30、40 min的提取效果，結果表明，超聲提取30 min提取效果最佳。最終確定供試品溶液的制備方法如下：

稱取梔子(9 g)、厚樸(12 g)和枳實(9 g)，剪碎后加入到圓底燒瓶中，加水300 mL，室溫浸泡30 min，回流提取1 h，待溶液冷卻后，采用5層紗布過濾，得到濾液；向圓底燒瓶中再加入300 mL水，重復上述提取過程，獲得濾液。合并兩次獲得的濾液，濃縮至50 mL，將濃縮液冷凍干燥24 h，制備梔子厚樸湯凍干粉，干燥器中保存備用。精密稱取全方凍干粉末樣品0.1 g(相當于生藥質量0.4 g)，放在50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲處理30 min，離心(13 000 r/min)10 min，取上清液經微孔濾膜(0.22 μm)過濾。取續濾液0.5 mL，用甲醇定容至25 mL，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備

稱取梔子、厚樸藥材，按“2.1.2”項下的方法處理，即得不含枳實的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件的優化與確定

2.2.1 色譜條件的優化

本實驗考察了2種不同的流動相體系(甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水)，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，各成分色譜峰峰形和分離度好，并能夠縮短分析時間，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水為最終流動相。此外，考察了3種不同型號的色譜柱(Shimadzu Shim-pack GIST柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；Shimadzu Shim-pack GIST柱，2.1 mm×100 mm，2 μm；Shim-Pack XR-ODS柱，75 mm×3.0 mm，2.2 μm)，結果表明，Shim-Pack XR-ODS色譜柱的分離效果最佳。

2.2.2 色譜條件的確定

色譜柱采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm，SHIMADZU)；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫(0～10 min，20%B～30%B)，平衡時間為5 min，流速為0.4 mL/min，柱溫設置為30 ℃，進樣量為5 μL，檢測波長為265 nm。所得色譜圖如圖1所示。

2.3 標準曲線的制備

取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，用甲醇配成系列混合對照品溶液(柚皮苷質量濃度分別為3、6、15、30、60、150 mg/L；新橙皮苷質量濃度分別為1、2、5、10、20和50 mg/L)，進樣分析，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品的濃度(X，mg/L)為橫坐標，柚皮苷和新橙皮苷的線性回歸方程分別為：

Y=7.659×103X-1.729×104，r=0.999 3

Y=1.617×104X-1.252×104，r=0.999 7

2.4 精密度實驗

取混合對照品溶液(柚皮苷質量濃度：30 mg/L；新橙皮苷質量濃度：10 mg/L)5 μL，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，柚皮苷和新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.58%和0.47%，即儀器的精密度符合要求。

1.柚皮苷；2.新橙皮

2.5 穩定性實驗

取同一份梔子厚樸湯凍干粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別于樣品放置0、2、4、8、12、24 h后進行分析，柚皮苷與新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.34%和0.53%，即樣品在24 h內穩定。

2.6 重復性實驗

取同一批梔子厚樸湯凍干粉樣品6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，柚皮苷和新橙皮苷的含量平均值(n=6)分別為10.98%和3.01%，RSD分別為2.4%和2.1%，表明方法重復性良好。

2.7 回收率實驗

取梔子厚樸湯凍干粉樣品粉末9份，每份0.1 g，加入相當于樣品中柚皮苷和新橙皮苷含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3份，按“2.1.2”項下的方法制備供試溶液，按“2.2”項下色譜條件測定。柚皮苷和新橙皮苷的平均回收率分別為98.9%和99.1%，結果見表1。

2.8 樣品含量測定

精密稱定6批次梔子厚樸湯凍干粉末樣品，依次編號為2019001～2019006。制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，計算柚皮苷和新橙皮苷的含量(外標法)。6批樣品測定結果見表2。

表 1 梔子厚樸湯凍干粉樣品中柚皮苷、新橙皮苷回收率

表 2 凍干粉樣品中柚皮苷和新橙皮苷的含量(%)

3 討 論

通過對6個批次的梔子厚樸湯中柚皮苷和新橙皮苷的含量進行測定，結果表明：柚皮苷的含量不低于10.45%，新橙皮苷的含量不低于2.95%。由此可見，柚皮苷的含量要顯著高于新橙皮苷。本研究建立了同時快速測定梔子厚樸湯中2個黃酮類成分(柚皮苷、新橙皮苷)含量的UFLC方法。該方法具有簡單、快速的優點。查閱相關文獻，沈震亞[9]建立了HPLC法同時測定了胃痛丸中柚皮苷和新橙皮苷的含量，分析時長為35 min，本研究所建立的UFLC分析方法能夠在7 min內實現柚皮苷和新橙皮苷的快速分離與測定，大大縮短了分析時間，提高了分析效率，將有助于梔子厚樸湯的后續質量控制研究。

本研究選取梔子厚樸湯中的柚皮苷和新橙皮苷作為測定指標也有助于梔子厚樸湯的臨床應用規范化和相關劑型的開發。隨著現代儀器技術的不斷提高和發展，未來UFLC技術將更多地應用到中藥的現代化分析與檢測中，將極大地推進中藥的國際化和現代化發展。