(25S)-26-OH-人參二醇的合成及抗宮頸癌活性研究

張馨妍，吳 迪，韓詩淇，韓 柳 (吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

宮頸癌是一種危害女性常見的惡性腫瘤，尤其是在發展中國家，其死亡率是在發達國家的18倍左右，占所有宮頸癌相關死亡人數的85%，嚴重危害女性健康[1]。(25S)-26-OH-人參二醇是近年來新發現的一種新型三萜皂苷類化合物，在治療冠心病、再灌注損傷、心律不齊、心肌缺血方面有很好的藥理作用[2]，并且具有其他人參皂苷不具備的藥理特性，這些優點使它具有很好的藥物開發價值。因此，有效制備出(25S)-26-OH-人參二醇，對下一步藥理作用的深入探討與新藥物的開發研制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；硅膠G板(青島海洋化工有限公司)；核磁共振儀(美國Varian公司)；(20S)-原人參二醇實驗室自制，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、乙酸酐(Ac2O)、氫氧化鈉、無水碳酸氫鈉、二氯甲烷(DCM)、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、叔丁醇鉀、過硫酸氫鉀復合鹽等試劑均為分析純。

1.2 (25S)-26-OH-人參二醇的合成

稱取23 g(20S)-原人參二醇(PPD)(50 mmol)和少量DMAP置于500 mL圓底燒瓶中，加入300 mL吡啶，室溫下攪拌至樣品溶解。然后緩慢滴加Ac2O 30 mL，室溫反應過夜。薄層色譜實時監測反應進程，反應結束后，向體系中加入飽和NaHCO3溶液，然后用DCM分次萃取，合并有機相。濃縮除去有機溶劑后加入飽和NH4Cl溶液洗滌3次。再次加入DCM萃取，有機相濃縮至50 mL，至圓底燒瓶中，向反應物中加入20 mL 10%的濃硫酸，并加熱回流7 h，同時薄層色譜實時監測反應進程。待反應結束后，取6 g叔丁醇鉀分批加入到反應體系中參與反應，反應完全后加入飽和NaHCO3溶液，用DCM萃取，濃縮有機相至呈油狀物，以50 mL甲醇溶解并加入等質量的NaOH，60 ℃回流4 h。用等體積水終止反應，稀硫酸調pH 3～5，用100 mL DCM萃取3次，合并有機相并濃縮，濃縮后產物經柱層析分離，二氯甲烷∶甲醇(25∶1)作為洗脫劑，乙酸乙酯重結晶，得25-烯-PPD 9.2 g。

將制得的25-烯-PPD加入到1，4-二氧六環中，直至全部溶解，經H2SO4調節pH值為3，在攪拌下逐滴加入氧化劑過氧間氯苯甲酸，于85 ℃加熱回流40 min，冷卻至室溫，用0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液調節pH值為7.0，過濾并濃縮濾液，得(25S)-26-OH-人參二醇粗品，該過程如圖1。將制得的(25S)-26-OH-人參二醇粗品裝入硅膠柱，以石油醚∶乙酸乙酯(1.0∶1)為洗脫劑進行柱層析分離，將分離下來的溶液旋蒸蒸干，以乙酸乙酯重結晶進一步純化，得(25S)-26-OH-人參二醇4.6 g。

圖 1 (25S)-26-OH-人參二醇的合成路線圖

1.3 人參二醇抑制HeLa細胞增殖的活性

取對數期生長細胞以4.5×105個/孔接種于96孔板，培養24 h后更換為含不同濃度的(25S)-26-OH-人參二醇培養基繼續培養24 h，小心棄去培養基，每孔中加入配好的CCK-8溶液100 μL，3副孔/組，并設置CCK-8檢測試劑空白對照組[3]。37 ℃恒溫培養箱孵育1～4 h后在450 nm吸收波長處進行OD值測量，以對照組OD值為1左右時的數值計算細胞增殖活性。

2 結 果

2.1 (25S)-26-OH-人參二醇的結構鑒定

白色粉末；MS m/z:477.4[M+H]+，確定分子式為C30H53O4；以氘代吡啶(pyridine-d5)為溶劑，在500 MHz下測定其核磁共振碳譜，得到1H NMR和13C NMR的譜圖。

具體數據信息如下：1H NMR(500 MHz,Pyr)δ3.91(q,J=10.9 Hz,2H),3.76(td,J=10.0,4.8 Hz,1H),3.45(dd,J=11.0,5.2 Hz,1H),2.20(td,J=10.4,5.1 Hz,1H),2.13(ddd,J=12.4,4.9,2.3 Hz,1H),2.01-1.94(m,2H),1.89-1.75(m,5H),1.74-1.67(m,2H),1.65(s,3H),1.63-1.57(m,2H),1.55-1.42(m,8H),1.40(s,3H),1.36-1.26(m,3H),1.24(s,3H),1.07(s,3H),1.05(s,3H),1.03-0.96(m,2H),0.93(s,3H),0.91(s,3H),0.84(dd,J=10.9,2.3 Hz,2H)；13C NMR(126 MHz,Pyr)δ78.68,78.49,77.71,70.98,67.72,56.91,52.72,52.67,51.02,49.75,40.57,39.96,39.91,37.84,35.62,32.82,32.54,32.48,29.06,28.67,28.00,27.93,27.89,27.49,19.24,18.49,16.99,16.74,16.64,16.21。由此確定合成的化合物為(25S)-26-OH-人參二醇。

2.2 (25S)-26-OH-人參二醇體外抗癌細胞活性結果

細胞實驗結果表明，(25S)-26-OH-人參二醇對HeLa細胞的增殖有一定的抑制作用。隨著藥物濃度劑量的加大，其抑制率逐漸升高，尤其是在濃度為75 mg/L時，其抑制率可達到36.14%(圖2)。

圖 2 (25S)-26-OH-人參二醇對HeLa細胞存活率的影響

3 討 論

本實驗以(20S)-原人參二醇為原料，經過乙?；?、加成、消除、氧化環合等步驟可以成功合成(25S)-26-OH-人參二醇，經過純化后其純度可達98.0%以上。但因合成步驟多，因此，嚴格控制好每一步的反應進程是其提高合成產率的關鍵。尤其是在最后的一步氧化環合過程，除了應用過氧間氯苯甲酸作為氧化劑之外，還可以選擇過氧化氫或過氧乙酸等強氧化性的物質來進行氧化環合[4]，但是這些氧化劑都會存在生成差向異構體的缺點。因此，后續研究手性催化劑使其通過不對稱的氧化環合作用，生成單一構型的產物，對于人參皂苷的合成具有重要意義。此外，(25S)-26-OH-人參二醇對HeLa細胞的增殖有一定的抑制作用，為其抗宮頸癌作用的研究奠定了基礎。