低溫對桂花萬點金葉肉細胞超微結構的影響*

尤揚，張曉云

1. 河南科技學院園藝園林學院，河南新鄉 453003

2. 河南省特色園藝植物開發利用工程技術研究中心，河南新鄉 453003

桂花Osmanthus fragrans為木犀科木犀屬常見園林植物，原產中國西南地區，在秦嶺、淮河以南等地均可露地越冬，河南新鄉為其自然分布的北線［1］。據南京林業大學國際木犀屬品種登錄權威向其柏教授研究，目前獲得國際品種登錄的桂花共有166 個品種。在這166 個桂花品種中，絕大多數分布于中國南方地區，北方地區由于低溫和鹽堿的影響，分布甚少。萬點金為金桂品種群桂花，主要分布在江浙一帶，為小喬木或叢生大灌木，高達5～7 m；葉片長橢圓形，基部寬楔形，尖端長漸尖，全緣葉常因葉緣波狀而皺；著花密集呈一個個花球，花深黃色或略呈淺橙黃色，雌蕊完全敗育而不結實；花期9 月下旬至10 月中旬［2］。

目前對桂花研究多集中于凍害調查［3］、低溫脅迫下生理生化指標的測定［4］、分子生物學研究［5］和野桂花群落調查［6］等方面。有關桂花葉片光學顯微鏡下的解剖結構偶有報道［7］，而北引桂花模擬外界低溫環境脅迫處理后葉片超微結構的研究鮮有報道［8］。本研究以從浙江金華引種到河南新鄉栽植的桂花品種萬點金為材料，采用超薄切片法，通過透射電子顯微鏡觀察拍照，研究一系列低溫脅迫下萬點金葉肉細胞的超微結構，摸清低溫脅迫下葉綠體、線粒體及溶酶體等細胞器的變化規律，以期在細胞學水平上厘清北引桂花葉肉細胞中細胞器的變化規律，為桂花的合理栽培及耐寒性鑒定提供依據，也為桂花品種耐寒性篩選提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

HITACHI-HT7700 型透射電子顯微鏡；LEICA EMUC7 切片機；智能人工氣候室；超凈工作臺；包埋板；磁力攪拌器等。0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（PBS）；φ=4% 戊二醛；系列體積分數梯度乙醇；φ=1.0 %鋨酸固定液；Epon 812；檸檬酸鉛染色液；醋酸雙氧鈾染色液等。

1.2 供試材料及低溫處理

桂花萬點金O. fragrans‘Wandian Jin’幼苗從浙江金華引種到河南新鄉，3 年生扦插苗，苗高100 cm 左右。引種苗栽于陶質盆缽之中，盆高為20 cm，盆口直徑為30 cm，盆內土壤養分含量如下： 堿 解 氮 含 量79.6 mg·kg-1， 速 效 磷 含 量28.6 mg·kg-1，速效鉀含量205.2 mg·kg-1，土壤容重1.29 g·cm-3，有機質含量為0.93%。桂花苗木日常土、肥、水、病蟲害等的管理措施同大田生產。

對照及低溫處理：對照材料于25 ℃常溫下取樣，葉片直接用φ=4%戊二醛固定。在低溫脅迫前先把各處理的5 株盆栽萬點金幼苗于10 ℃下預冷處理48 h；在智能人工氣候室中進行模擬低溫處理：溫度依次設定為5、0 和-5 ℃；光照強度設置為150 μmol·m-2·s-1，光照時間設定為12 h；溫度下降速率設定為每10 min下降1 ℃，當溫度降至既定溫度時保持48 h后立即進行取樣固定。

1.3 葉片細胞超薄切片制備

試驗參照李和平［9］的方法進行超薄切片的制備，略有改動。每個低溫處理隨機選取5株萬點金盆栽幼苗的3 個枝條，從該枝條頂端向下數第3 或4 片葉（健壯、無病蟲害）取樣：在事先預冷的石蠟面板上和葉片擬取樣部位各滴上一滴預冷的φ=4%戊二醛溶液，使得取樣部位完全接觸到φ=4%戊二醛溶液；在葉片取樣部位用Leica 刀片避開葉片主脈快速切取1.0 mm×0.5 mm 大小的組織塊，立即用預冷過的醫用鑷子謹慎地把材料轉移到事先裝有φ=4%預冷戊二醛溶液的青霉素小瓶中；用醫用注射器（20 mL）抽氣20 min 左右至絕大多數組織塊下沉至瓶底部為止，材料置于冰箱上層4 ℃條件下前固定6 h；用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（PBS，pH 為7.0）沖洗3 次，每次30 min；用鋨酸（φ=1.0%）進行后固定6 h；再用同種磷酸緩沖液漂洗3 次，每次30 min；乙醇溶液系列脫水（由于材料較嫩，從較低的體積分數開始）30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%（重復一次），每個梯度30 min；丙酮過渡；環氧樹脂Epon812 滲透、包埋；于35、45 和60 ℃下分別聚合12、12、和48 h；用LEICA EMUC7 型超薄切片機鉆石刀切片；25 ℃下進行醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙重染色；HITACHI-HT7700 型透射電子顯微鏡下觀察拍照，每個處理取20個觀察視野進行研究。

2 實驗結果

2.1 常溫下萬點金葉肉細胞超微結構

桂花萬點金在常溫（25 ℃）下葉肉細胞的解剖結構如圖1所示：細胞結構正常，細胞壁清晰完整（圖1-A，圖1-B）。細胞核被中央大液泡擠向了細胞邊緣，核膜完整清晰，電子密度較高的核仁呈不規則棱柱狀，位于核的近似中央部位（圖1-A，圖1-B）。觀察視野中非導管細胞葉綠體數量為1～13個，葉綠體結構完整，呈餅狀或凸透鏡狀分布于細胞壁的內側，葉綠體膜清晰可辨，由于尚未形成基粒內囊體結構，這種葉綠體為前葉綠體（圖1-B）。葉綠體內有少量白色的淀粉粒和電子密度較高的嗜鋨體（圖1-B）。觀察視野中單個細胞內線粒體數量為0～4 個。葉肉細胞中還發現少許初級溶酶體（圖1-C）：單層膜圍繞的囊狀細胞器，球形，內容物均一；常溫下萬點金葉肉細胞次級溶酶體的數量較少。觀察視野中單個細胞溶酶體的數量為2～6 個。試驗中發現了環紋導管的縱切結構，每隔一定的距離有一木化增厚的次生壁結構加在導管里面的初生壁上（圖1-D）；在導管分子的橫切圖上發現其側壁并非完全增厚，未增厚的部分形成了紋孔（pit）（圖1-E，圖1-F）；導管分子在形成過程中，次生壁整體加厚，液泡膜破裂，分解成多個小液泡，細胞核變形呈不規則柱狀（圖1-F）。隨著導管分子的進一步發育，其內部的一些細胞器逐步消失，成熟的導管形成一個中空的結構（圖1-E）。

圖1 常溫下萬點金葉肉細胞超微結構Fig.1 Ultrastructure of O.fragrans‘Wandian Jin’at normal temperature

2.2 5 ℃處理下萬點金葉肉細胞超微結構

隨著處理溫度的降低，在5 ℃脅迫時萬點金葉肉細胞核結構正常（圖2-A）。觀察視野中葉綠體數量為2～13個；部分葉綠體較之常溫時發生了一定程度的腫脹（圖2-A），而有些葉綠體則并未發生腫脹現象（圖2-C），這也為低溫過后的恢復生長提供了光合作用的物質基礎；葉綠體基粒片層電子密度較高、垛疊整齊有序、清晰可辨（圖2-C）；5 ℃的低溫處理時，葉綠體內嗜鋨體的數量較常溫時有了一定的增加；葉綠體內含的淀粉粒有明暗相間的條紋（圖2-A）。此溫度下，線粒體的數量也較之常溫有了數量上的增加，觀察視野中單個細胞內線粒體數量為1～6 個，并且聚集在葉綠體周圍（圖2-A）。溶酶體是一種異質性的細胞器，形態大小都有很大不同［10］。5 ℃低溫脅迫下，觀察視野內單個細胞內溶酶體的數量較常溫時有了明顯增加，觀察視野中單個細胞內溶酶體數量為3～12個。初級溶酶體結構簡單呈球形，內容物均一，沒有明顯的顆粒物（圖2-A，圖2-B，圖2-D）。次級溶酶體結構復雜多樣，形態不規則，有的次級溶酶體呈極度不規則形（圖2-A）；有的則呈圓球形（圖2-B、圖2-E），內含顆粒、膜片等；有的呈近似同心圓環狀（圖2-C）。圖2-C 左下角溶酶體（SL 字母所示，標尺為1 μm）為該圖中黑色箭頭所指溶酶體的放大圖，這種近似同心圓環狀的溶酶體可看作是圖2-E 所示溶酶體的后期狀態，而圖2-D中溶酶體可以看作是圖2-E中溶酶體的早期狀態。試驗中還發現了胞間連絲（圖2-F中黑色箭頭所示）。

圖2 5 ℃處理下萬點金葉肉細胞超微結構Fig.2 Mesophyll cells ultrastructure of O. fragrans‘Wandian Jin’at 5 ℃

2.3 0 ℃處理下萬點金葉肉細胞超微結構

0 ℃低溫脅迫下，萬點金葉肉細胞結構正常，細胞壁層次清晰，質膜完整（圖3-A，圖3-B），試驗中發現了胞間連絲（圖3-A 黑色箭頭所示）。細胞核核膜清晰，核質均勻，電子密度較高的核仁在觀察視野中呈黑色立方體狀（圖3-A）。觀察視野中葉綠體數量為3～13個；葉綠體腫脹，部分葉綠體呈橢球形（圖3-B，圖3-C），基粒內囊體電子密度較高呈黑色，基粒片層垛疊整齊；嗜鋨體較多；淀粉粒有亮暗相間的條紋（圖3-B，圖3-C），并且淀粉粒有腫脹變大的現象（圖3-C）。線粒體數量較常溫時有增多現象，觀察視野中單個細胞內線粒體數量為2～8個，呈圓球形聚集于葉綠體的附近（圖3-A）。0 ℃低溫脅迫時，萬點金葉肉細胞初級溶酶體、次級溶酶體、殘質體共存。初級溶酶體結構簡單，內容物均一，呈圓球形（圖3-B）。次級溶酶體結構復雜多樣，大小不一，內含多種生物大分子、膜片、顆粒等結構（圖3-C，圖3-D）。近似同心圓環狀的多泡體聚集在一起構成了次級溶酶體（圖3-E），試驗中還發現有電子密度較高的蛛網狀次級溶酶體（圖3-F）。觀察視野中單個細胞內溶酶體數量為4～12個。

圖3 0 ℃處理下萬點金葉肉細胞超微結構Fig.3 Mesophyll cells ultrastructure O. fragrans‘Wandian Jin’at 0 ℃

2.4 -5 ℃處理下萬點金葉肉細胞超微結構

桂花萬點金葉肉細胞在-5 ℃低溫脅迫下細胞壁結構完整，層次清晰。細胞核核膜清晰，核質均勻，電子密度較高的核仁位于核的一側（圖4-A）。觀察視野中葉綠體數量為4～12個；葉綠體較前期的低溫脅迫腫脹更加劇烈，呈橢球形、半球形，部分葉綠體離開細胞壁的內側，向細胞中央游離（圖4-A，圖4-B）；部分葉綠體有縊縮現象（圖4-B）；由于脅迫溫度較低，淀粉粒加劇水解轉化為可溶性糖，提高了細胞滲透勢，從而有利于抵御低溫帶來的傷害，故此，葉綠體中淀粉粒的數量較之前期低溫處理變得非常少見，只在極個別的葉綠體中發現了淀粉粒；葉綠體中油體（oil body）的數量較多，呈球形或橢球形，近圓球形的油體是植物體內貯藏形式較為經濟的營養物質（圖4-B）。線粒體數量比常溫時有了一定的增加，這可能是緣于植物對低溫的一種響應；線粒體呈球形、橢球形，結構完整，內嵴清晰，聚集在葉綠體周圍，觀察視野中單個細胞內線粒體數量為4～10個。-5 ℃低溫脅迫下，初級溶酶體結構簡單，內容物均勻，呈圓球形（圖4-C）、新月形（圖4-D）；此溫度下次級溶酶體結構復雜，呈球形（圖4-E）、不規則形（圖4-F）等。觀察視野中單個細胞內溶酶體數量為4～15個。溶酶體的主要功能是消化作用，在維持細胞正常代謝活動和防御方面均有著重要作用［10］。

圖4 -5 ℃處理下萬點金葉肉細胞超微結構Fig.4 Mesophyll cells ultrastructure of O. fragrans‘Wandian Jin’at-5 ℃

當脅迫溫度降低到-5 ℃時，發現有桂花萬點金葉肉細胞有結冰現象。冰晶的形狀各異，由于透射電鏡照片看到的僅是一個二維剖面圖像，不是三維立體結構，所以就觀察視野看到的而言，有柱狀冰晶、方形冰晶、針狀冰晶、點狀冰晶及不規則形冰晶。細胞內外均有結冰的現象：細胞內結冰主要在原生質或液泡內進行，細胞內結冰體積相對較小，形態不一，數量較多，排列無序，零星散落于液泡內（圖5-A，圖5-B）；胞間結冰冰晶的體積相對較大，冰晶的形狀多樣且無序，冰晶隨機分布于胞間（圖5-C）。研究中發現桂花萬點金在-5 ℃低溫脅迫下有質膜內陷的現象（圖5-C黑色箭頭所示）。

圖5 -5 ℃處理下萬點金葉肉冰晶超微結構Fig.5 Mesophyll cells ultrastructure of ice crystals in O. fragrans‘Wandian Jin’at-5 ℃

3 討論與小結

現有研究表明，細胞器及膜結構穩定性的提高是植物抵御外界低溫脅迫的重要方面［11］。本試驗研究發現，于-5 ℃低溫脅迫下，桂花萬點金葉肉細胞有質膜內陷的現象（圖5-C黑色箭頭所示）。質膜內陷的生理意義在于增加了細胞質膜的比表面積，擴增了細胞排水總面積，從而便于低溫時細胞內水分快速排出，延緩了細胞內部的結冰速度，一定程度上減輕了植物的低溫傷害。從本研究結果來看，細胞核在系列低溫脅迫下的穩定性較強，沒有發生明顯的變化。葉綠體則是植物細胞中對低溫脅迫十分敏感的細胞器［12-13］。本研究發現隨著低溫脅迫程度的加劇，葉肉細胞葉綠體腫脹的現象越來越劇烈，直至-5 ℃低溫處理時，桂花萬點金葉肉細胞部分葉綠體呈現橢球形、球形，甚至部分葉綠體脫離了細胞質膜內側，向細胞中央游離（圖4-A，圖4-B）。逆境脅迫下葉綠體腫脹的現象在多種農林作物上均有報道［14-18］。尤揚等［8］研究人工低溫脅迫桂花品種狀元紅時發現：在5 ℃低溫處理時，葉綠體有輕微膨大現象，0 ℃處理時葉綠體腫脹加劇，-10 ℃處理時，葉綠體降解。有文獻對大花丹桂［19］低溫脅迫下葉肉細胞的超微結構研究發現：0℃和-5 ℃脅迫時葉綠體膨脹加劇，細胞內線粒體的數量有增加現象；-10 ℃和-15 ℃處理時，葉肉細胞發生嚴重的質壁分離，細胞器崩潰降解。潢川金桂葉肉細胞葉綠體腫脹的現象在自然降溫條件下也有報道，在過低的溫度下，有細胞質壁分離，甚至有細胞壁破損的現象［20］。就本文涉及的溫度和桂花狀元紅、大花丹桂和潢川金桂在低溫脅迫下同溫度的超微結構相比較來看，葉綠體的反應基本一致。由于本研究并未涉及-10 ℃的低溫脅迫，故此未見桂花萬點金葉肉細胞葉綠體崩潰解體，也沒有看到質壁分離和細胞壁破裂的現象。

本試驗研究發現，相對于葉綠體而言，在一定低溫范圍內，線粒體于低溫脅迫下是一種比較穩定的細胞器。這也和桂花狀元紅、大花丹桂和潢川金桂葉肉細胞線粒體在低溫下的反應類似，也同時表明相同溫度下，線粒體對低溫的敏感性不及葉綠體。

就本試驗來看，桂花萬點金葉肉細胞的溶酶體在每個試驗處理中均存在。常溫處理時，溶酶體的數量較少，觀察視野內以初級溶酶體居多，其形態多呈圓球形，結構簡單，內容物均一。隨著脅迫溫度的降低（5 ℃、0 ℃、-5 ℃），觀察視野中溶酶體的數量較之對照的常溫處理有了一定程度增加，初級溶酶體、次級溶酶體和殘質體均有發現。低溫脅迫下溶酶體數量增加，不僅能及時清除一些無用的衰老的細胞器、生物大分子等物質，作為細胞內的消化“器官”，溶酶體還可為身處低溫逆境下的細胞提供一定的營養物質，進而有利于桂花抵御低溫帶來的傷害。

低溫結冰對植物造成的傷害有兩種類型，一是細胞內結冰傷害，二是細胞間結冰傷害。就本試驗研究來看，胞內結冰（圖5-A，圖5-B）和胞間結冰（圖5-C）兩種類型均有發現。細胞內結冰破壞了原生質的結構，致使細胞亞結構破壞、酶活動無序、組織分離、代謝紊亂；胞間結冰造成細胞間隙冰晶過多時會對原生質引發機械損傷，當溫度回升時，冰晶融化較快，細胞壁容易恢復原貌，而原生質吸水膨脹要緩慢得多，結果可能會導致原生質被撕裂，繼而對細胞造成傷害［21］。

總之，一定低溫條件脅迫下桂花萬點金葉肉細胞葉綠體腫脹變形；淀粉粒減少，部分淀粉粒腫脹變大；線粒體增多；次級溶酶體增多，結構復雜；-5 ℃的低溫脅迫下，出現了胞內結冰和胞間結冰的現象；葉綠體的穩定性可以作為桂花抗寒的一個重要參考指標。