不同模式表面等離子體共振與其他分析檢測技術聯用

趙 欣， 王瑞敏， 康 青*， 汪鵬程， 周飛艨*

(表面分析與化學生物學研究院，濟南大學，山東濟南 250022)

1 引言

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是發生在金屬與介質界面的一種光學現象。當一束光以大于臨界角從光密介質傳播到光疏介質時，在界面的全反射使本應折射的光束返回光密介質。而實際上有部分入射光會滲透到光疏介質中，平行于界面傳播(消逝波)。消逝波在光疏介質中傳播一段距離會再回到光密介質，而當消逝波的頻率與金屬表面振蕩的自由電子(即等離子)頻率一致時，等離子將吸收入射光的大部分能量發生共振，使反射光能量減少直至完全消失，這時的入射角稱為共振角(SPR角)。SPR角隨金屬表面的折射率變化而產生變化。因為在表面的分子吸附能導致質量變化而引起折射率的變化，所以共振角的移動、反射光強度的變化和調制的相位均可用來獲得分子吸附過程和分子間結合的定量信息。由于所有物質均有折射率，因此SPR技術具有免標記和高靈敏度等優點[1]。近年來SPR技術得到了迅猛的發展，SPR與其他檢測技術的聯用可結合多種技術的優勢，中科院長春應用化學研究所的牛利教授課題組、北京大學的劉虎威教授課題組、南京大學的王偉教授課題組等已分別對SPR-電化學[2]、SPR-質譜[3]、SPR顯微鏡成像[4]技術特征進行了詳盡的概括和總結。但據我們所知，尚未有比較SPR三種模式(常規SPR，成像SPR，SPR顯微鏡技術)的同異性和應用體系的綜述。鑒于趙藻藩先生在分析化學尤其是電分析化學方面的卓越成就，作為紀念論文之一的本文著重在三種模式的分析技術特性(Analytical Figures of Merit)和其與多通道流通體系，和以電化學為代表的其他檢測技術的聯用方面的工作進行介紹。

圖1A所示的常用SPR裝置是Kretschman結構。當樣品流經芯片表面時，樣品中的待測物會與芯片表面的預先固定的配體發生特異性結合，使傳感芯片表面折射率隨時間變化，從而產生SPR傳感譜圖(Sensorgram)。通過對傳感譜圖的模擬和分析準確得到分子結合親和力和動力學速率常數的數據[5]。由于免標記，受配體的結構及其之間的結合不受影響，SPR[6]和等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC[7])已成為測量分子間親和力等熱力學參數的最佳手段，且SPR還能獲得動力學速率常數。

鑒于常規SPR模式無法進行高通量分析，蛋白質/核苷酸陣列和SPR技術結合催生了SPR成像技術(Surface Plasmon Resonance imaging,SPRi)。與常規SPR必須先后分析多種待測物不同的是：SPRi可同時記錄微陣列芯片上每個陣列點產生的傳感譜圖[5,8]，因此可以對復雜樣品中的多個待測物予以高通量分析，大大節省了分析時間和樣品量[9]。圖1B所示的SPRi模式中，通過棱鏡放大的入射光束覆蓋芯片上預先打印的各陣列點，反射光被CCD相機捕獲而成像[5]。由于常規SPR可以在無需移動光學部件的前提下通過對共振角的移動和改變反射光強度[5,10]得到傳感譜圖，因此噪音小，信噪比好于SPRi。尤其通過相位調制[11]和局域化SPR(Localized SPR)[12]，靈敏度還可提升至少一個數量級。

SPRi使用的三角棱鏡會將擴大的光斑扭曲為橢圓型，且SPRi成像儀空間分辨率(100 μm[13])不高，因此SPR顯微鏡成像(Surface Plasmon Resonance Microscopy,SPRM)技術應運而生[14,15]。如圖1C所示，SPR與倒置顯微鏡相結合，大大提高了分辨率[4]。同時利用倒置顯微鏡自帶的光源獲得SPRM感應區的明場圖像，SPR圖像的每個像素處均可產生對應的傳感譜圖，空間分辨率高達～1 μm。因此可用于可視化研究，如細菌、細胞、病毒、囊泡以及納米粒子等[4]。特別是對細胞膜蛋白分子與配體或藥物的相互作用的研究，使常規SPR以及SPRi只能望其項背[4]。但SPRM作為一種新技術，還有很多基礎問題和現象需要研究，與常規SPR以及SPRi相比，在通量和相互作用動力學研究數據的準確性上尚待完善。

圖1 SPR的三種模式。(A)常規SPR[1],示意圖中的三角棱鏡常以半圓棱鏡取代，且包括對共振角的移動和反射光強度變化或相位調制予以鎖相放大等檢測方法；(B)SPRi[5]；(C)SPRM。(D)SK-BR3細胞的SPRM圖像[16]。(E)SK-BR3細胞的典型SPR傳感譜圖[16]。Fig.1 The three modes of SPR.(A) A conventional SPR system[1],the triangular prism shown in this representative diagram is commonly replaced by a hemispherical prism and the detection mechanism includes the measurements of the SPR resonance angle and the intensity of the reflected light near the angle and monitoring the phase shift of modulated light by a lock-in amplifier;(B) An SPR imaging system[5];(C) SPR microscopy.(D) A typical SPR image of SK-BR3 cells [16].(E) The SPR sensorgrams of SK-BR3 cells [16].

表1對比了三種SPR模式的技術特征。三種SPR模式的測量對象和應用范圍不盡相同，因此在生物分析、生物物理和化學生物學、藥物研發中扮演不同的角色，可說是取長補短，相得益彰。因此三種模式均已有商品化的儀器。

表1 SPR、SPRi、SPRM模式的技術特征和應用對象比較[17-20]Table 1 Comparison of the figures of merit and applications among SPR,SPRi and SPRM[17-20]

(續表1)

2 SPR聯用技術

近年來，常規SPR傳感己趨于成熟，因此SPR技術與其他技術聯用成為研究熱點。聯用技術可彌補SPR不能鑒定分子結構和消除表面存在一些干擾等的不足，并能進一步提高檢測的靈敏度和選擇性。

2.1 與微流控和多種流動注射系統的聯用

微通道流通系統是SPR生物傳感測量的一個關鍵部分，其控制精度不僅與獲取的數據的可靠性相關，也決定了耗樣量和傳質速率大小等因素。細窄的SPR流通池通道一般通過微加工實現，樣品的遞送可通過微流控裝置或流動注射分析系統控制。早期基于常規SPR模式的流通池為雙通道(其中之一作為參比通道用于扣除背景信號)，為獲得多個傳感譜圖需要將不同濃度的待測物先后注入配體覆蓋的分析通道中，且每一次分析后必須對傳感芯片予以再生。近年來開發出的多通道系統不僅提高了通量，改變了傳統的分析流程，還可以靈活地控制不同的通道的開啟與關閉而進行雙通道SPR無法實現的實驗。如本課題組通過有序地關閉流通池的五個通道，只需要注射一次配體溶液即可在五通道SPR儀中的四個流通通道中固定不同密度的配體(圖2A)。然后一次注射待測分子即可同時得到扣除第五通道背景后的四條不同傳感曲線(圖2B)。該方法流程簡單，避免了芯片再生的篩選和優化，從而降低了樣品和芯片的消耗[21]。我們還開發了一種雙閥進樣流通體系，提高了生物識別分子固定量和免再生SPR檢測的靈敏度[26]。該方法可以實現一種或多種樣品以串聯或并聯方式進樣。這種交替注射模式不僅節省進樣時間，還能高效簡便地固定配體，防止待測物的解離。這種檢測方法同樣避免了常規方法對生物復合物重復解離而再生芯片的步驟，并將SPR拓寬到了由于芯片再生而導致蛋白二級結構無法恢復的體系的研究中。

微流控技術可以組建更多的通道、進樣接口、平行排布相同的結構單元[27 - 30]，因此微流控技術與SPR聯用可以更大地提高檢測通量[28,30,31]和減少樣品消耗。例如日本產業技術綜合研究所的Kurita課題組采用微流控多通道SPR圖像識別技術對細胞狀態進行了評估[22]。他們用聚二甲硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)原料制備了流通池，在SPR芯片上修飾五種不同結構的半胱氨酸衍生物。獲取了正常細胞和4種癌細胞的培養基中細胞代謝物與不同的半胱氨酸衍生物相互作用產生SPR傳感響應圖樣(圖2C、2D)。該方法所設計的多通道微流控體系消耗樣品少(～25 μL)且測量快捷(10 min)，所獲得的信息全面且不依賴特定的生物標記物。這種細胞無損傷的圖像識別方法有望成為表征細胞的通用工具。此外美國斯坦福大學的Demirci課題組開發了一種便攜式、免標記的病原體檢測平臺[32]。該平臺整合了微流控和SPR技術，顯示了對細菌病原體(如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)現場即時定量檢測的能力，彌補了傳統的病原體檢測法(如酶聯免疫法和聚合酶鏈反應)耗時長的不足，有望推廣到其他病原體檢測或用于臨床診斷中。另外，微流控連續進樣通過PDMS模具(圖2E)一次性制備微陣列芯片可用于G蛋白及對應抗體的SPRi檢測[23]。該技術可以在芯片表面來回進樣孵育，增加了固定密度、減少了樣品消耗、縮小了傳統點樣針打點造成的點間差異，提高了檢測通量。近期96通道的微流控進樣器配合96點的微陣列芯片，可以自動檢測9216(96×96)次分子間的相互作用[33]。類似的微陣列芯片也被應用于新冠病毒抗體的檢測。通過注射不同類型的免疫球蛋白抗體(anti-IgA，anti-IgG和anti-IgM),新冠病人血清在微陣列芯片上會產生不同的響應信號(圖2F),可以對病人血清中各類免疫球蛋白進行定量分析[24]。Rinat-Pfizer公司推出了一種運用水平和垂直雙向微流控裝置制備微陣列芯片的方法(圖2G)[25]。在水平方向注射待測物，垂直方向注射配體。在不同通道不同位點實現了不同待測物活化固定，并以此分析了36種IgG與15種生物肽的相互作用[25]。

圖2 (A)通過自下而上先后關閉通道來固定不同量的前列腺特異性抗原(PSA)抗體(彎曲箭頭表示溶液流動方向；褐點為控制通道關閉和打開的端口[21])。(B)往預先固定了0.078、0.148、0.268和0.458 ng·mm-2 牛血清蛋白(BSA)的通道中單次注射300 nmol·L-1 BSA抗體[21]。(C)固定有半胱氨酸衍生物的多通道SPR芯片的照片[22]。(D) 由半胱氨酸衍生物和不同組分的細胞培養基之間的交叉反應產生的SPR響應信號[22]。(E)聚二甲硅氧烷微流控打印模型。每個點孔有兩個微孔，通過微流控連續注射控制待測物的固定[23]。(F)SPRi微陣列檢測血清中新冠病毒抗體含量。通過不同點對應的血清與免疫球蛋白抗體產生的信號，定量各類免疫球蛋白含量[24]。(G)雙向微流控制備微陣列芯片示意圖[25]。Fig.2 (A) Immobilization of bovine serum albumin onto different fluidic channels via sequential closures of the channels from downstream up.The direction of the solution flow is shown by the curved arrows and the ports for channel closure and opening are denoted by the brown dots [21].(B) A single injection of 300 nmol·L-1 anti-BSA antibody into channels pre-immobilized with 0.078,0.148,0.268,and 0.458 ng·mm-2 BSA[21].(C) A photograph of the cysteine derivative-covered multichannel SPR chip for pattern-recognition-based cell sensing [22].(D) SPR response patterns resulting from cross-reactive interactions between cysteine derivatives and cell culture media with different components[22].(E) A polydimethylsiloxane(PDMS) microfluidic printer[23].(F) Anti-SARS-CoV-2 immune globulins SPRi assay.The process of spotting sera samples to a RBD-coupled surface and its resultant SPRi reflectivity image [24].(G) Schematics of the dual-directional microfluidic method as an array biosensor[25].

電化學技術可以研究物質伴隨電子轉移在表面的吸脫附或是表面吸附物的氧化還原過程[2]。電分析雖然可以靈敏地測量單分子或亞單分子層吸附物，但伏安曲線易受充電電流和復雜體系中多峰重疊現象等因素的干擾。雖然各種光譜電化學方法可以提供很多結構方面的信息，但對吸/脫附物的定量往往求助于如石英晶體微天平(QCM)等能測量質量變化的技術。如前所述，SPR測得的折射率的變化其實與質量變化定量相關[2,6]。因此，SPR也是一個質量檢測器，且靈敏度高于QCM。比如基于10 MHz 的晶振的靈敏度為5 ng·cm-2[36],而SPR的靈敏度高達0.01～0.1 ng·cm-2。因此電化學SPR(EC-SPR)已有較長的研究和應用歷史。本文主要針對電化學與三種SPR模式聯用的案例和數據解讀需要考慮的因素進行探討。

EC-SPR技術已發展到多個領域，如痕量檢測[37,38]、表面吸脫附過程[39]、電聚合反應過程[40 - 42]、電極反應動力學常數的測定[43]、生物分子間相互作用[44]以及生物傳感[45,46]。循環伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)與SPR技術聯用可靈敏地測量氧化還原過程中吸附物的質量，甚至是表面固定的生物分子構型的細微變化。和QCM測得的質量變化必須考慮吸附物的粘彈性和傳感器的靈敏度分布[36]一樣，EC-SPR 需要考慮測得的共振角變化(Δq)由于吸附層厚度(Δd)和電荷密度(Δs)的變化產生的信號：

Δq=c1Δd+c2Δn+c3Δs

(1)

其中，Δn為電極表面折射率變化，c1、c2和c3為系數。

在循環伏安過程中電極表面電荷密度s隨掃速v變化：

s=vCd[t-RsCd+RsCde-t/RsCd]/A

(2)

公式(2)中，Rs是溶液電阻，Cd是雙電層電容，A是電極面積。

因此循環伏安過程中雙電層的充電電流不斷變化會一直改變電極表面電荷密度，使得SPR信號的解析變得復雜。我們發現電位階躍法(Potential-step Chronoamperometry,PSC)比循環伏安法更適合與SPR聯用以精確測量電沉積薄膜的厚度[34]。

在PSC法中：

s=ECd[1 -e-t/RsCd]/A

(3)

根據估算，充電電流會在極短的時間內(少于1 ms)達到穩定值(ECd/A)，大大小于電沉積和電聚合等過程需要的成核時間。我們用PSC-SPR觀測到了成核步驟后二維擴展成單層銅膜，以及三維生長成聚苯胺的過程，而這一過程在僅用循環伏安或用循環伏安-SPR是不易觀察到的。當雙電層充電電流減小后SPR測得的電聚合薄膜的厚度與原子力顯微鏡(AFM)測的十分吻合(圖3A、3B)。另外重慶大學的胡衛華課題組采用PSC-SPR技術首次對電化學介導表面引發的原子轉移自由基聚合過程進行了原位現場檢測[35]。圖3C為他們所用裝置圖，將含有CuBr2和聯吡啶、甲基丙烯酸縮水甘油酯和KCl溶液流過SPR檢測及參比通道，通過PSC法調控活化劑的比率來引發、控制、終止金膜表面聚合反應過程(圖3D)。

圖3 (A)1.0 mmol·L-1苯胺溶液中電位從0.0 V階躍至0.7 V的q -t圖(插圖是在1.0 mmol·L-1苯胺+100 mmol·L-1 HClO4(黑色曲線)和100 mmol·L-1 HClO4(藍色曲線)溶液中用電位階躍從0.0至0.7 V獲得的計時電流圖[34]。(B)膜形成后Au/聚苯胺邊界的AFM圖像(底部的高度圖對應于AFM圖像中白色線條部分[34])。(C)用于原位電化學介導表面引發的原子轉移自由基聚合過程的EC-SPR設置[35]。(D)電位從開路電位步進至0(a)、-0.03(b)、-0.06(c)、-0.10(d)和-0.15 V(e)時的SPR響應(箭頭表示施加電位的時刻[35])。Fig.3 (A) q -t diagram upon a potential step from 0.0 to 0.7 V in 1.0 mmol·L-1 aniline(Inset is the chronoamperograms obtained from the potential step from 0.0 to 0.7 V in 1.0 mmol·L-1 aniline +100 mmol·L-1 HClO4(black curve) and in 100 mmol·L-1 HClO4(blue curve)[34]).(B) An AFM image of the Au/PAni boundary after the film formation(The cross-sectional contour at the bottom corresponds to the white line in the AFM image[34]).(C) Illustration of the EC-SPR Setup for in-situ electrochemically mediated surface-initiated atom transfer radical polymerization(eSI-ATRP) investigation [35].(D) Simultaneous SPR response for stepping the potential of a gold chip from the open-circuit potential to 0(a),-0.03(b),-0.06(c),-0.10(d),and -0.15 V(e)(The arrow indicates the moment when the potential was applied[35]).

早期電化學和SPRi的聯用主要是利用電化學方法制作陣列[49]，或利用施加的電場加快表面吸附過程[50]，但由于SPRi的局部成像分辨率不高，而靈敏度又低于常規SPR，因此EC-SPRi 此后并沒有得到更多的關注。近年來SPRM解決了SPRi成像不清晰和靈敏度的問題，且成像速度明顯快于掃描探針顯微技術(SPM，當然對比于SPM納米區域的成像SPRM還是難以媲美)，因此SPRM和電化學結合的EC-SPRM具有獨特的應用前景。與EC-SPR不同的是：EC-SPRM一方面可獲得電極或金屬膜不同部位的電化學過程的精細圖譜，另一方面又可以通過施加的電位或電流增強SPRM圖像的對比度。但EC-SPRM聯用技術也受雙電層充電電流[51]和表面過程[52]的影響。美國亞利桑那州立大學的陶農建教授課題組將PSC與SPRM技術聯用，能夠在毫微秒響應時間內檢測微電極上的細胞色素c的氧化還原反應和相對應的構象變化(圖4A)[47]。研究結果表明電子轉移過程中的構象門控發生在從微秒到毫秒的較寬時間范圍內(圖4B、4C)。另外，同一課題組還對單根金納米線(AuNW)的表面電化學反應進行了等離子成像研究[48]。若AuNW上發生電化學反應，其SPR散射強度也會隨之發生變化，從而提供了單根AuNW的電化學信息。該設計消除了傳感層的干擾，同時保留了清晰的SPR響應，首次獲得了單根AuNW的循環伏安圖。他們還研究了單根AuNW上不同位置的局域電化學反應的差別(圖4E、4G)。

圖4 (A)具有超快光學檢測功能和小型化微電極的等離子體電化學顯微鏡(P-ECM)裝置圖[47]。在10 μs內的氧化(B)和還原(C)過程中的P-ECM擬合數據。氧化過程中電極電位從-0.3 V階躍至+0.3 V；還原過程中電極電位從+0.3 V階躍至-0.3 V [47]。(D)等離子體電化學顯微鏡(P-ECM)實驗裝置圖[48]。(E) 單根10 μm 金納米線(AuNW)的明場光學圖像[48]。(F)該AuNW在-0.2 V下對應的P-ECM圖像。黑色虛線表示AuNW的位置[48]。(G)位于AuNW上標為1,2兩個位點的等離子體CV 曲線(藍線和紅線)和多根AuNW的常規CV曲線(黑線)，電解質為0.2 mol·L-1 NaOH，電位循環速率為0.2 V·s-1[48]。Fig.4 (A) Optical setup of plasmonics-based electrochemical microscopy(P-ECM) with ultrafast optical detection and miniaturized microelectrodes[47].P-ECM fitting data during oxidation(B) and reduction(C) over 10 μs.The electrode potential was stepped to +0.3 V from -0.3 V during oxidation,to -0.3 V from +0.3 V during reduction[47].(D) Experimental setup of plasmonics-based electrochemical microscopy(P-ECM).(E) Optical transmission image of a 10 μm AuNW[48].(F) A P-ECM image of the AuNW at -0.2 V.The black dashed line marks the location of the AuNW[48].(G) Plasmonic CVs from two locations on the AuNW(blue and red curves) and the conventional CV over a large ensemble of AuNW(black curve,and see also the inset).The electrolyte is 0.2 mol·L-1 NaOH,and the potential cycling rate is 0.2 V·s-1[48].

交流阻抗法 (Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS)[53]缺乏空間分辨率，一定程度上限制了其用于電化學過程的研究。陶農建教授課題組將電化學阻抗與SPRM結合成為電化學阻抗等離子體成像技術(Plasmonic Imaging of Electrochemical Impedance,P-EIM)，用于研究電化學反應[54]、分子結合動力學[55]、動態檢測單細胞的凋亡和電穿孔過程中[56]。P-EIM的檢測利用金膜表面SPR效應對表面電荷密度的高靈敏性，通過施加交流電測量相應的SPR信號，并將直流和交流組件分別轉換為SPR和電化學阻抗顯微(Electrochemical Impedance Microscopy,EIM)圖像[57]。該SPR圖像對傳感表面質量變化敏感，可測量細胞的質量分布和動力學，EIM圖像可提供細胞阻抗或電化學反應的有關信息[56,57]。例如運用P-EIM技術在亞細胞水平上對單個神經元動作電位的啟動和傳播進行成像[58]。此技術所用的光學器件與傳統的膜片鉗和熒光顯微鏡兼容，從而可以使用多種技術研究同一樣品。因此該技術將有助于研究各種不同細胞中的電生理行為。

2.3 與其他技術聯用

由于SPR流通池可以和很便捷地與各種流動體系結合，所以SPR已與高效液相色譜[59]、毛細管電泳[60]、各種質譜(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization和Electrospray Ionization)[61,62]等聯用。與QCM聯用保留了SPR的對質量變化的靈敏性，同時利用QCM技術提供薄膜厚度及粘彈性結構等信息[63,64]。另外SPR和掃描電化學顯微鏡(Scanning Electrochemical Microscopy,SECM)[65]聯用可以研究電化學誘導的表面局部反應。與熒光光譜[66,67]、紅外光譜[68]、橢圓偏振[69]等光學技術聯用也可以進一步提高檢測的靈敏度和分辨率，以獲取吸附物的結構信息。

3 結論與展望

本文比較了三種SPR模式的分析技術特性、應用范圍、各種流動體系以及以電化學方法為代表的多種分析技術的聯用?；诔Ｒ幠Ｊ降腟PR商品化后經過長達近40年的應用和芯片開發，已成為免標記研究分子間相互作用和藥物研發等方面不可或缺的一個分析技術，日臻成熟的SPRi則在高通量檢測和篩選以及組學研究方面鋒芒畢露，異軍突起的SPRM有望在針對單細胞膜蛋白為靶點的藥物研發、細胞器的相關生物功能和活動的研究、單個納米顆粒的結構研究等方面發揮其獨特的作用。若要使SPRM的技術優勢發揮得淋漓盡致，尚需進一步對SPRM觀察的一些微納尺寸的界面和區域的現象進行深入地基礎研究。至于SPR的在線聯用和原位觀察也好，離線使用也罷，只要是兩種和多種技術得當地應用在一個體系的研究中，往往能提煉出單一技術無法獲取的信息。而要做到和這三種SPR模式的珠聯璧合，就一定要了解乃至排除影響SPR信號變化的諸多因素，這些因素包括吸附分子的質量和極化性(兩者均影響折射率)、吸附膜厚度、表面電荷、固/液界面和溶液溫度、機械振動對光學系統的干擾等。一方面，其他技術既可提升SPR的技術特性和拓寬SPR技術應用范圍；另一方面，SPR又可為其他技術提供一個實時、靈敏、免標記的檢測手段。

隨著科技的快速發展，相信這三種SPR模式的性能將繼續提高，與其他檢測技術的聯用也會更加多樣化。在人類還在繼續與各種病原體及其變種頑強斗爭的今天，能快速篩選各種疫苗、抗體、藥物的技術將備受青睞；同時，開發能滿足實時現場臨床檢測需求的微型化便攜式儀器的努力還在繼續，SPR在這兩個方面都具有其獨特的優勢和潛力。