G-四聚體和G-三聚體DNA在電化學生物傳感中的應用

趙玲麗， 周穎琳*， 張新祥*

(北京分子科學國家研究中心，生物有機與分子工程教育部重點實驗室，北京大學化學與分子工程學院，北京 100871)

1 前言

G -四聚體是由富鳥嘌呤(Guanine，G)的單鏈核酸通過Hoogsteen氫鍵折疊形成的特殊核酸高級結構，因其結構和功能的多樣性，G -四聚體被作為一個多功能的信號元件，廣泛應用于小分子、蛋白質，以及與疾病相關的特征核酸序列等與生命活動密切相關的生物標志物的分析檢測[1 - 3]。近年來G -三聚體作為G -四聚體的折疊中間體被確認為一種新的核酸結構[4]，它具有構成新型核酸分子探針的良好應用潛力[5，6]。

近30年來，電化學生物傳感器因其響應速度快、易于小型化、成本低、選擇性好、靈敏度高等優點受到越來越多的關注[7 - 9]。隨著即時檢測(Point-of-Care Testing，POCT)成為體外診斷的一大風向標[10，11]，基于G -四聚體或G -三聚體的電化學傳感器作為一種特殊的傳感器件，受到研究人員的關注并得到了長足發展，為POCT體外診斷提供了新途徑。本文主要針對G -四聚體和G -三聚體DNA在電化學傳感中的應用進行簡要評述，總結了此類電化學生物傳感器在金屬離子、有機小分子、核酸和蛋白大分子，以及酶活性等分析檢測方面的最新研究成果。

2 G -四聚體和G -三聚體

2.1 G -四聚體

近年來，人們發現Watson-Crick雙鏈結構的許多變體在一些細胞生命過程中起著關鍵的作用，例如發夾結構、十字形結構、平行雙鏈結構、DNA三聯體、G -四聚體和i-motif結構等。這些結構可以由分布在整個人類基因組中的核酸序列構成，它們的位置不是隨機的，通常與人類疾病的發生息息相關[12]。這些特殊的核酸結構通常是在堿基堆積和氫鍵相互作用的穩定下，由一到四條鏈組成，并以各種非常規的配對方式存在。其中，G -四聚體吸引了研究人員的廣泛關注。人類端粒末端富含鳥嘌呤的序列和原癌基因啟動子序列都可通過折疊形成G -四聚體的拓撲結構。G -四聚體的結構由8個Hoogsteen氫鍵穩定的G -四分體平面堆疊組成，O原子居中定位于環中，形成一個陰離子雙錐籠，可以與單價陽離子如Na+或K+配位[13 - 14]，見圖1。G -四聚體表現出豐富的拓撲結構多樣性[15]，它的結構與鳥嘌呤區的數量和長度、loop區的長度和連接方式、鏈的取向，以及溶液中金屬離子的性質都密切相關。G -四聚體拓撲結構的多樣性為小分子配體提供了變化多樣的結合位點，這是G -四聚體被廣泛應用于電化學生物傳感器的重要基礎。

圖1 G -四分體和G -四聚體的化學結構[16]Fig.1 Chemical structures of G -quartet and G -quadruplex[16]

2.2 G -三聚體

隨著研究的深入，G -四聚體結構的重要性日益凸顯，這促使人們進一步分析其折疊機制，并開始尋找新的涉及富鳥嘌呤序列多態性的結構。2013年，一種新的G -三聚體核酸結構，作為凝血酶適配體TBA(G -四聚體結構)的一個穩定的折疊中間體被Limongelli等[4]首次確定。該團隊利用核磁共振波譜、圓二色光譜、差示掃描量熱法等生物物理學研究手段，證實了該結構的存在，并表征了其結構和熱力學性質。如圖2所示，該新結構具有特殊的“G -三聚體”結構，是由一系列Hoogsteen氫鍵穩定的G∶G∶G三分體平面折疊構成的。G -三聚體一經發現就引起了人們極大的研究興趣，其具備構成新型核酸分子探針的良好應用潛力。目前G -三聚體在電化學生物傳感器中的應用方興未艾。

圖2 G -三聚體結構的示意圖[4]Fig.2 Structure of G -triplex[4]

3 基于G -四聚體或G -三聚體的電化學傳感器

G -四聚體和G -三聚體能被作為信號轉導分子，這是由于G -四聚體和G -三聚體的折疊和去折疊對環境刺激有響應。第一類刺激物是K+、Cs+、Pb2+等金屬離子，它們可以穩定G -四聚體的結構；第二類刺激物是小分子物質，如ATP和可卡因等；第三類刺激物是生物大分子，如核酸分子和蛋白質等。上述刺激物均可能是某些情況下人們感興趣的檢測目標，且不同的目標物會直接影響生物傳感器中的G -四聚體或G -三聚體對目標物進行響應的機制。下面對基于G -四聚體或G -三聚體開發的電化學生物傳感器進行介紹。

3.1 對金屬離子的檢測

多種一價和二價金屬離子對G -四聚體和G -三聚體結構具有穩定作用。特別是某些富含鳥嘌呤的寡核苷酸序列對特定的金屬離子具有很高的選擇性。這些發現被用于開發基于G -四聚體或G -三聚體的金屬離子電化學傳感平臺。Fu等[17]報道了一種基于DNA構象變化的電化學生物傳感器，用于檢測超痕量的稀土Tb3+。該團隊將一段標記有巰基的富G序列固定在金電極表面，當Tb3+存在時，富G序列從柔性的單鏈結構轉變為剛性的G -四聚體結構，G -四聚體的形成提高了Au電極表面的電荷密度，對帶負電荷的鐵氰化鉀造成排斥，從而導致電化學響應信號的降低。該體系對Tb3+的檢測范圍為0.68～5.5 nmol/L，檢出限為61 pmol/L。Liu等[18]受到K+對G -四聚體構象轉換的誘導作用啟發，建立了一個基于納米通道的電化學平臺，用于K+的快速檢測。當目標分子被引入納米通道時，固定在通道中的適配體折疊成G -四聚體結構。這種構象轉換導致納米通道中空間位阻的顯著增加，從而導致納米通道中的指示劑分子氫醌通量的降低。指示劑分子通量的變化可通過其在工作電極上的陽極電流進行監測，從而簡單快速地實現對K+檢測，檢測范圍為5～200 μmol/L，檢出限為0.4 μmol/L。Li等[19]基于穩定的T-Hg2+-T相互作用，開發了一種簡單、靈敏、無標記的檢測Hg2+的電化學傳感器。在目標分子存在下，富G序列被特異性識別并折疊成平行型G -四聚體結構，與氯化血紅素(Hemin)形成具有過氧化物酶活性的DNA酶，從而觸發H2O2介導的電化學氧化3,3,5,5-四甲基聯苯胺。該體系對Hg2+的檢測范圍為100 pmol/L～100 nmol/L，檢出限為33 pmol/L。Liu等[20]利用DNA四面體探針上的特異性DNA酶，開發了一種新型的Pb2+的電化學生物傳感器(圖3)，在Pb2+的存在下，底物鏈被切割成兩部分，釋放出一段富G序列，隨后形成G -四聚體/Hemin復合物，在H2O2的輔助下產生可檢測的催化電流信號。三維DNA四面體調節了探針的密度和取向，改善了脫氧核酶反應，促進了電極表面界面受限空間內復雜的DNA構象變化，該生物傳感器的檢測范圍為0.01～1 000 nmol/L，檢出限為8 pmol/L。

圖3 基于G -四聚體的電化學生物傳感器檢測Pb2+的示意圖[20]Fig.3 Illustration of the Pb2+ electrochemical biosensor based on the G -quadruplex[20]

3.2 對有機小分子的檢測

針對與生命活動密切相關的有機小分子等生物標志物，發展快速、廉價、靈敏和高選擇性的檢測方法是生物化學分析的重要課題之一，而基于G -四聚體或G -三聚體的電化學傳感器為這一課題提供了新思路。

可卡因是一種從古柯植物的葉子中提取的生物堿，是一種與人類健康息息相關的小分子化合物。本課題組以可卡因為模型，發展了一系列基于G -四聚體或G -三聚體的電化學傳感器。在醫療中可卡因被用作局部麻醉藥或血管收縮劑，同時可作強效的天然中樞興奮劑，但也因其對中樞神經系統的興奮作用而導致濫用，成為世界性的主要毒品之一。2013年，Zhang等[21]報道了一種無標記、無固定化的均相電化學核酸適配體傳感器。所設計的單鏈功能核酸序列包含了可卡因核酸適配體序列和G -四聚體序列，經過緩慢退火處理后，該功能核酸序列在溶液中形成莖環結構，其中雙鏈互補的莖的部分包含了一部分核酸適配體序列和一部分G -四聚體序列。這一優勢構象通過堿基互補阻礙了G -四聚體構象的形成。而在可卡因存在的條件下，可卡因與核酸適配體的親和相互作用使得功能核酸的構象發生變化，莖的結構打開，釋放出G -四聚體結構，與Hemin結合形成DNA酶，表現出過氧化物酶活性，催化氫醌和H2O2反應，產生可觀測到的還原準穩態電流的變化。所使用的電化學裝置由一次性槍頭和可重復使用的碳纖維超微電極組成，可在微升水平的溶液中進行檢測。該體系對可卡因的檢測范圍為1～500 μmol/L，最低檢出濃度為1 μmol/L。亞甲基藍(MB)是一種帶有芳香結構的陽離子類吩噻嗪染料，本課題組首次發現其對G -四聚體DNA的親和力高于對ssDNA或dsDNA的親和力[22]，是鮮有的能特異性結合G -四聚體的電活性探針。2014年，Zhang等以G -四聚體/MB復合物為基礎，設計了核酸適配體/G -四聚體雙功能核酸發夾結構用于可卡因的電化學傳感器。在可卡因存在下，MB與被釋放的G -四聚體作用，具有相比于雙鏈DNA更強的結合力，從而引起MB的擴散電流的明顯降低。該體系對可卡因的檢測范圍為5～1 000 μmol/L，最低檢出濃度為5 μmol/L。該方法證實了G -四聚體/MB復合物作為一種有潛力的電化學探針，可用于均相免標記的電化學傳感器的構建中。隨后，該探針被廣泛使用，發展為基于G -四聚體電化學均相分析的重要電化學指示劑用于miRNA的檢測[23]、DNA邏輯門的構建[24]、甲基化轉移酶活性的檢測[25]等。2019年，為了探究G -四聚體與MB相互作用的關鍵部位，本課題組Zhao等[26]通過對前述G -四聚體核酸序列的截短，發現了一條與MB結合更加緊密的富G序列(G3)。與G -四聚體序列相比，該序列與MB結合后使得體系電流降低更為顯著。我們證實了該序列可形成穩定的G -三聚體構型。進一步地，Zhao等以耦合了核酸適配體(作為目標識別元件)與G3(作為信號報告元件)的雙功能核酸序列為基礎，構建了可卡因的電化學傳感器(圖4)。與基于G -四聚體的傳感器相比，該傳感器不僅背景干擾更小，且信號響應更強，對可卡因的檢測范圍為0.1～1 000 μmol/L，最低檢出濃度為0.1 μmol/L。

圖4 基于G -三聚體的電化學生物傳感器檢測可卡因的示意圖[26]Fig.4 Illustration of the cocaine electrochemical biosensor based on the G -triplex[26]

最近，Zhang等[27]利用G3/MB作為信號報告分子，結合微型一體化電極成功構建了檢測三聚氰胺的均相、免標記的電化學傳感平臺?；谛叵汆奏?T)與三聚氰胺可以通過氫鍵形成“T-三聚氰胺-T”三聯體結構這一規律，該團隊設計了一種單鏈功能核酸傳感器，起初G3序列和富T序列均被掩蔽在功能核酸形成的發夾結構中。當三聚氰胺存在時，它與T的結合會導致功能核酸發生構象變化，釋放出G3，G3與MB生成復合物輸出電信號。該方法對三聚氰胺的檢測范圍為100 μmol/L～2.5 mmol/L，檢出限為100 μmol/L。

3.3 對核酸分子的檢測

DNA和RNA在現代分子生物學中扮演著重要角色，因此核酸的檢測意義重大[28]。靈敏、高選擇性地檢測核酸分子，對于基因治療、突變分析和臨床診斷均具有關鍵的指導作用[29 - 31]。G -四聚體和G -三聚體介導的電化學傳感器具有穩定簡便的優點，為核酸的檢測領域提供了新的選擇。

本課題組Nie等[32]發展了靶標促發的恒溫指數放大反應(R-EXPAR)，結合微電極小型化電化學設備的檢測。R-EXPAR放大后的大量G -四聚體序列(約10-7～10-6mol/L)可以與Hemin結合形成DNA酶，通過DNA酶/氫醌/H2O2體系產生電化學信號。對信號報告基團G -四聚體進行檢測發現，經R-EXPAR放大靈敏度可提高5個數量級。該策略被成功應用于對靶標DNA的靈敏檢測，檢測范圍為5 pmol/L～1 nmol/L，最低檢出濃度為1.7 pmol/L。這種無須標記、固定化的小型電化學檢測具有操作簡單、成本低廉、高重復性和可靠性的優勢。該策略不只局限于核酸生物標志物的檢測，若利用核酸適配體識別相應靶標，信號轉換促發G -四聚體序列產生，亦可利用R-EXPAR急劇放大信號輸出，實現對不同靶標小分子、大分子的靈敏檢測。理論上講R-EXPAR可以應用到任何以釋放一條G -四聚體序列為信號報告基團的POCT檢測中。本課題組Zhao等[33]以G3/MB為信號報告分子，構建了一種新型均相的無標記電化學傳感平臺，實現了對腫瘤標志物MicroRNA的靈敏檢測。如圖5所示，在該傳感器中，首先通過一步核酸線性放大反應識別MicroRNA，并將痕量的MicroRNA轉化為G3，進而借助恒溫指數放大擴增反應在短時間內迅速擴增產生大量G3，其與MB形成G3/MB復合物作為報告分子輸出電化學信號。該體系對MicroRNA的檢測范圍為1 fmol/L～10 nmol/L，最低檢出濃度為0.45 fmol/L，并且可實現對MicroRNA單個堿基的區分。該工作成功地拓展了G -三聚體/MB作為一種高效、靈敏的核酸探針的應用范圍，揭示了其作為一種生物傳感探針在未來具有取代G -四聚體的應用潛力。此外這種便攜、低成本、高效的電化學方法可能成為DNA-配體相互作用研究的一種強大工具。

圖5 基于G -三聚體的電化學生物傳感器檢測MicroRNA的示意圖[33]Fig.5 Illustration of the MicroRNA electrochemical biosensor based on the G -triplex[33]

3.4 對蛋白質和酶活性的檢測

蛋白質在自然界中無處不在，是生命所必需的。在蛋白質組學時代，人們期望發現大量與疾病相關的蛋白質和酶的生物標志物，而蛋白質和酶的檢測方法是認識、預防、診斷和治療許多疾病不可或缺的工具。

Liu等[34]報道了一種競爭免疫分析法，檢測微囊藻毒素-LR的無酶多重放大電化學傳感器。微囊藻毒素-LR是指亮氨酸(L)和精氨酸(R)在兩個可變位置。該團隊將具有大比表面積的Au納米樹枝晶電沉積在ITO電極上，作為免疫傳感器的基底來捕獲抗原。隨后，合成了內嵌有MB的單分散核殼結構的SiO2復合物作為免疫傳感器的標記物，負載二抗用于免疫反應，同時修飾有DNA引物用于信號增強。當目標物存在時，兩條輔助DNA鏈引發原位雜交鏈式反應，在SiO2復合物的表面形成雙螺旋DNA，加入Hemin后，在其兩側形成大量的DNA酶。最后，將MB插入到形成的雙螺旋DNA中，進一步提高檢測信號。在MB的輔助下，所形成的DNA酶可以催化H2O2的還原，從而產生電流信號。該體系對微囊藻毒素-LR的檢測范圍為0.5 ng/L～25 μg/L，檢出限為0.3 ng/L。Xiang等[35]利用Cu2+和焦磷酸(PPI)的配位作用，以及G -四聚體/Hemin納米線對信號的放大作用，成功實現了對人體內酸性磷酸酶(ACP)的檢測。Cu2+和PPI可以形成穩定的PPI-Cu-PPI化合物。PPI作為ACP的水解底物，可被水解成不能與Cu2+配位的磷酸根離子，從而抑制PPI-Cu-PPI的形成，并釋放游離Cu2+激活電極上Cu2+-DNA酶的活性。進一步地，底物鏈發生催化裂解，釋放出原本掩蔽在底物鏈中的富G序列，進而與溶液中游離Hemin發生結合，在電極表面生成G -四聚體/Hemin納米線絡合物。這種表面受限的Hemin有望在不涉及任何標記的情況下帶來大幅放大的電流信號，從而實現對ACP的靈敏檢測，檢測范圍為1～125 U/L，檢出限為0.45 U/L。該方法還被成功應用于選擇性地檢測血清樣品中的低水平ACP。

在對蛋白質和酶活性的檢測中，G -四聚體除了作為信號報告分子，還可作為目標物的適配體參與識別過程，產生構象變化。如圖6所示，Zhang等[36]基于此構建了一種結合凝血酶-適配體復合物的光驅動再生式電化學生物傳感器。光致變色的偶氮苯基團能調控 G -四聚體結構的折疊和去折疊。電極上修飾了二茂鐵(Fc)和偶氮苯標記的凝血酶適配體，在檢測到凝血酶后，適配體序列識別目標物發生構象變化，折疊形成G -四聚體結構，3′端修飾的Fc與電極表面的距離縮短，Fc的電流信號增大。在紫外光照射下，插入適配體中的偶氮苯由反式結構轉變為順式結構，適配體結構變得松散，遠距離阻斷了Fc的電子傳遞，實現了適配體的再生。該體系對凝血酶的檢測范圍為5 pmol/L～5 μmol/L，檢出限為3 pmol/L。

圖6 基于G -四聚體的電化學方法檢測凝血酶的示意圖[36]Fig.6 Illustration of the thrombin electrochemical biosensor based on the G -quadruplex[36]

4 結論

本文主要綜述了功能核酸分子G -四聚體和G -三聚體與電化學檢測技術相結合構建的電化學生物傳感器。在這些電化學生物傳感器中，G -四聚體和G -三聚體能夠將生物識別事件轉換成各種讀出信號，實現對與生命活動相關的小分子、蛋白質以及與疾病相關的特征核酸序列等生物標志物的分析檢測。此類生物傳感器具有快速、靈敏、低成本和能夠便攜檢測生物或化學分子的優勢，在檢測中表現出巨大的應用潛力，并為POCT體外診斷提供了新途徑。

同時，我們也必須認識到這些基于G -四聚體和G -三聚體的電化學傳感器仍然存在一些局限性。首先，除了有限數量的金屬離子和蛋白質外，并不是所有的金屬離子都能被檢測到。為了將基于G -四聚體和G -三聚體的技術推廣到更廣大的領域，必須使用其他綜合生化策略對其進行優化和改進。其次，這些傳感策略的信噪比仍有很大的提高空間。最后，因G -三聚體較差的結構穩定性，迄今為止已報道的基于G -三聚體的電化學傳感器還非常有限。本綜述介紹了部分基于G -四聚體和G -三聚體的電化學檢測平臺，但其應用的范圍肯定遠不止于此，本領域的研究仍然大有可為。