莠去津對谷子農田土壤微生物群落結構的影響

黃瀟 蔡穎慧 趙小珍

摘要：以山西省太原市陽曲縣谷子種植區土壤為研究對象，運用IlluminaHiSeq高通量測序技術，分析莠去津脅迫下土壤微生物群落結構變化。由α多樣性指數分析可知，莠去津降低了土壤微生物的豐富度和群落多樣性，噴灑濃度越高，豐度和多樣性越低;在黃土高原谷子種植區，土壤真菌主要門類為子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）;土壤細菌主要門類為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門 （Gemmatimonadetes） 、擬桿菌門（Bacteroidetes）。從門、綱水平上進行分析，高濃度莠去津污染土壤樣品和低濃度莠去津污染土壤樣品中的優勢真菌和細菌種類基本相同。

關鍵詞：莠去津;谷子農田;土壤微生物;高通量測序;真菌;細菌

中圖分類號： X53 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0210-04

莠去津別稱阿特拉津，是一種內吸選擇性除草劑，可以有效防除多種一年生禾本科和闊葉雜草，殺草譜廣，在世界范圍內被廣泛應用于谷類作物生產中。但殘留于土壤中的莠去津會影響后茬作物生長，污染農田土壤，造成地下水污染，導致土地“癌化”，還會給土壤微生物帶來不可估量的破壞。土壤微生物參與土壤碳、氮等元素的循環，發揮著有機質分解、養分轉化、有害物質降解等重要作用，可通過硝化、固氮、土壤酶釋放、生物降解等生化過程來改善土壤生態系統，土壤微生物是影響土壤質量的重要因素之一。研究除草劑施用后土壤中微生物的群落組成結構，對于改善土壤結構具有重要的理論指導意義[1-4]。

本研究對山西省谷子主產區之一——陽曲縣的土壤樣品進行土壤理化性質分析，并通過IlluminaHiSeq高通量測序，分析其微生物群落組成及多樣性，比較不同程度莠去津干預下土壤微生物的群落結構差異，對于了解莠去津對土壤微生物群落的影響及土壤微生物恢復，為建立谷子產區莠去津污染檢測的生物指標奠定理論及試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地點位于山西省太原市陽曲縣定點試驗田（112°32′15.35″E、38°05′18.06″N）。試驗地地勢平坦，境內屬暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫 6～9 ℃，年平均降水量為441.2 mm，無霜期為 164 d 左右。試驗區的土壤類型為山西黃土，供試作物為谷子。

1.2 試驗設計與取樣

1.2.1 試驗設計 采用38%莠去津水懸浮劑，試驗時間為2017年6月上旬至7月上旬，對谷子幼苗3～4葉期進行噴霧處理。根據相關文獻報道的莠去津的處理劑量和正常使用情況下土壤中莠去津的濃度[5-6]，藥劑用量設計為4個處理，即：0、2、5、8 L/hm2。

1.2.2 土壤取樣 2019年9月份，采用五點法取樣采集2～20 cm表層土樣。過2 mm篩子，去除雜草、碎石等雜質，4 ℃保存待用。部分土樣自然風干，用于土壤基本理化性質測定。測定方法參照國際中的測定方法，每個樣品做3個平行測定[7]。供試土壤樣品的理化性質見表1。

1.2.3 土壤樣品PCR 采用生工生物工程（上海）股份有限公司的基因組DNA快速抽提試劑盒進行土壤樣品DNA的提取。稱取0.5 g保存于 4 ℃ 冰箱中的土壤樣品，按試劑盒說明書過程提取土壤樣品總DNA;將提取得到的DNA溶解于50～100 μL TE Buffer中，20 ℃保存。

細菌擴增：選擇16S rDNA V4區域擴增通用引物，以5～50 ng DNA 為模板，PCR 擴增細菌DNA片斷[8];真菌擴增：選擇ITS2 可變區擴增通用引物，以5～50 ng DNA 為模板，PCR 擴增真菌 ITS rDNA[9]。

1.2.4 高通量測序 采用2%濃度的瓊脂糖凝膠對土壤樣品PCR產物進行電泳檢測，利用膠回收試劑盒回收產物。構建真菌ITS rDNA、細菌16S rDNA V4區域文庫，Qubit 和實時定量 PCR檢測合格后，通過Illumina MiSeq上機測序[9-10]。

1.3 數據分析

對測得的土壤樣品的所有序列進行聚類、分析，按照97%的相似度將獲得序列聚類成同一分類操作單元OTUs，通常每一個 OTU被視為一個微生物物種。將OTUs與ITS rDNA、16S rDNA片斷進行比對，并對OTUs 的代表序列進行物種注釋分析，確定擴增序列對應的微生物，并分析不同物種分類水平下各樣本的群落組成。根據 OTU 分析結果，對樣本序列進行隨機抽樣，采用Qiime 1.9.1計算土壤微生物α多樣性指數[11-12]。

2 結果與分析

2.1 不同濃度莠去津下土壤微生物群落組成

土壤微生物高通量測序結果（表2）顯示，從4個土壤樣品中共檢測到325 182個真菌原始序列數，屬于子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）5個菌門;共檢測到441 513個細菌原始序列數，屬于變形菌門（Proteobacteria） 、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes） 、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi） 、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）這9個菌門。依據97%的相似度劃分為真菌OUTs數為393～489，細菌OUTs數為593～705。

2.2 不同莠去津干擾下土壤微生物多樣性分析

多樣性指數是用來測定物種豐富度和均勻度的綜合指標，主要有3個空間尺度：Alpha（α）多樣性、β多樣性、γ多樣性。其中α多樣性，重點關注均勻生境下的物種數目，通過單樣本的多樣性分析反映樣品內微生物群落的豐富度和多樣性。通常有測序深度指數（Observed spieces 和Goods coverage）、菌群豐度（Chao1和ACE）和菌群多樣性指數（Shannon和Simpson）。Goods-coverage指數數值越高，表示樣品被測出的概率越高;Chao1或ACE指數越大，表示群落豐富度越高;Shannon指數越大，表示群落多樣性越高[13-14]。

由表3可知，對照土壤中真菌與細菌ACE指數和Chao1指數均為最高，說明沒有噴灑莠去津的土壤樣品中，物種豐度最高;對照土壤中Shannon指數最高，說明土壤群落多樣性最高;而在莠去津噴灑濃度為8 L/hm2情況下，ACE指數、Chao1指數和Shannon指數均為最低，說明在此噴灑濃度下，土壤微生物群落豐富度和多樣性均最低。

2.3 不同濃度莠去津下土壤微生物群落組成

不同濃度莠去津脅迫條件下，土壤微生物優勢物種的相對豐度如圖1、圖2所示。土壤真菌主要門類為子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、壺菌門、球囊菌門，在4個土壤樣品中這5個門的相對豐度可分別占平均值的61.9%、12.5%、6.8%、1.9%和0.9%，另外，未明確分類真菌（Unidentified）也占有較高比例（16.2%）。土壤中細菌優勢菌群為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門，分別平均占比30.38%、15.76%、12.69%、8.29%、6.12%，其相對豐度之和可以占到73.24%，相對豐度超過2%的還有厚壁菌門 （3.92%）、綠彎菌門（3.59%）、浮霉菌門（2.17%）、疣微菌門（2.0%）。

由圖1、圖2可以看出，噴灑不同濃度莠去津土壤中微生物優勢門類相對豐度有一定的差異。真菌類群中，接合菌門在4種土壤樣品中的相對豐度變化不大;擔子菌門和球囊菌門的相對豐度在對照土壤中高于其他3種噴灑過莠去津的土壤。對照土壤以及噴灑濃度為2 L/hm2的土壤中子囊菌門相對豐度大于莠去津噴灑濃度為5、8 L/hm2的土壤;在細菌類群中，變形菌門在4種土壤樣品中的相對豐度變化不大;其他門類細菌在對照土壤中相對豐度均大于噴灑莠去津的土壤。未噴灑過莠去津的對照土壤中微生物多樣性更為豐富。

進一步考察樣品中土壤微生物在綱水平下的優勢相對豐度。如圖3所示，4種土壤樣品中真菌綱水平的優勢物種主要有傘菌綱（Agaricomycetes，23.03%） 、糞殼菌綱（Sordariomycetes，16.38%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes，2.59%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，4.69%）、未明確分類真菌（Unidentified，15.56%）、錘舌菌綱（Leotiomycetes，3.97%） 、絲孢綱（ Hyphomycetes，1.64%）、球囊菌綱 （Glomeromycetes，0.32%）、其他 （Others，31.82%）。

如圖4所示，4種土壤樣品中細菌的優勢菌綱為γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria，12.29%）、α-變形菌綱（α-Proteobacteria，10.87%）、β-變形菌綱（β-Proteobacteria，9.67%）、酸桿菌綱（Acidobacteria，11.34%）、放線桿菌綱（Actinobacteria，10.69%）、芽單胞桿菌綱（Gemmatimonadetes，7.45%）、酸微菌綱（Acidimicrobiia，5.71%）、硝化螺菌綱（Nitrospira，2.58%）、浮霉菌綱（Planctomycetacia，2.03%）。同時，γ-變形菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、酸桿菌綱、放線菌綱為優勢菌綱，其相對豐度之和可以占到總數的54.86%。

土壤樣品中，傘菌綱的相對豐度最高，可占到所有真菌綱的18.6%～27.7%，糞殼菌綱的相對豐度可以占到所有真菌綱的14.7%～19.1%。細菌中，變形菌綱的相對豐度最高，可占到所有細菌綱的30%以上。對照土壤和莠去津濃度為2 L/hm2的土壤樣品中，優勢菌綱的相對豐度變化不大，但均大于5、8 L/hm2的土壤中優勢菌綱的相對豐度。未噴灑莠去津的對照土壤中微生物多樣性更為豐富。

3 結論與討論

土壤微生物參與土壤碳、氮等元素的循環及養分的轉化過程，可以調控土壤碳截獲能力和有機碳礦化過程，影響生態系統生產力，在一定程度上可以直接反映土壤肥力的高低[15]，同時土壤微生物比較敏感，易受到外界環境條件的影響。土壤類型、含水量、有機碳和總氮含量等理化性質以及作物種類、種植制度、土壤類型、水肥管理等農業管理措施都會影響土壤微生物群落結構[16-18]。在本研究中，以山西省黃土高原谷子種植區土壤為研究對象，考察不同濃度莠去津干預下土壤真菌和細菌菌群結構變化情況。由于受其他人為干擾因素較少，4種類型的土壤樣品理化性質差異不顯著，莠去津為影響土壤微生物群落結構的主要因素。

研究結果表明，未噴灑過莠去津的對照土壤中微生物多樣性更為豐富。從門、綱水平上對黃土高原谷子種植區土壤真菌和細菌群落進行分析，結果表明不同濃度莠去津脅迫下土壤樣品中的優勢真菌種類基本相同，但優勢真菌的相對豐度不同。谷子種植區土壤真菌的優勢門類為子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、壺菌門、球囊菌門，優勢綱類為傘菌綱、糞殼菌綱;細菌的優勢門類為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門，優勢綱類為 γ-變形菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、酸桿菌綱、放線菌綱，這與絕大多數土壤細菌的優勢細菌種類基本相同[18-19]。

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