山銀花總黃酮提取工藝優化及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

易燦，周新崇，王亞舉，劉進兵

(邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽，422000)

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]，主要分布在長江以南的湖南、四川、廣東、貴州、廣西、云南、江西、浙江及海南等省份。山銀花是我國傳統的藥食兩用植物，含有豐富的綠原酸、黃酮類、酚類物質等生物活性物質[2]，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、降血糖和降血脂等功能[3-4]。

山銀花的有效成分提取方法主要有水提法[5]、回流醇提法[6]、超聲波提取法[7]、微波提取法[8]、酶解法[9]和超臨界提取法等[10]。水提法操作簡單、安全、環保、生產成本低，但雜糅、蛋白質等雜質較多，后續提純較為復雜[5]。超聲、微波提取法與水提、醇提法提取率較高，但操作步驟繁瑣，不利于工業生產[11]。

研究發現，山銀花除了在制藥行業有開發價值外，在食品和化妝等領域也有市場價值。本實驗利用微波輔助法提取山銀花總黃酮并進行優化，并測定了其α-葡萄糖苷酶的抑制活性，運用酶動力學探討了微波輔助提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機制，為進一步綜合利用山銀花資源提供參考。

1 材料與儀器

隆回山銀花(湖南省隆回縣農貿市場)；阿卡波糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；蘆丁對照品(純度≥98%)(中國食品藥品檢定研究院)；α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,G5003-100UN)，對硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(美國Sigma化學公司)，其他均為國產分析純。

SF-130型高速中藥粉碎機(中南制藥機械廠)；MCR-3常壓微波化學反應器(鞏義市中天儀器科技有限公司)；UV-2600型紫外可見分光光度計(島津(上海)實驗器材有限公司；Thermo U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；PT-3502C全波長酶標分析儀(北京普天新橋技術有限公司)；Cary Edipse熒光分光光度計(安捷倫科技有限公司)。

2 方法

2.1 總黃酮含量的測定

2.1.1 山銀總黃酮的提取

將去雜后的山銀花花蕾攤平于瓷盤中，置于60 ℃電熱鼓風干燥箱中，恒溫干燥24 h至干燥。將烘干的山銀花花蕾樣品于中草藥粉碎機中粉碎，過 60 mm，樣品裝入磨口瓶中，置于4 ℃冰箱中保存備用。

精確稱取1.00 g經石油醚脫脂12 h的粉末，按一定料液比，加入適量一定濃度的乙醇，在一定時間內進行微波輔助提取，提取完成后過濾，將濾液減壓濃縮，再用70%乙醇定容至25 mL，作為待測液備用。

2.1.2 黃酮提取率的測定

黃酮類化合物的測定采用硝酸鋁比色法[12]。精密吸取待測液200 μL于10 mL EP管中，加5%的亞硝酸鈉溶液200 μL，靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液200 μL，靜置6 min后再加4%的氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻，靜置15 min，最后，以75%的乙醇溶液定容至10 mL。在波長為510 nm處用紫外分光光度計測吸光值，將吸光度(A)代入蘆丁回歸方程公式：C=0.012 86A-0.008 14，R2=0.999 02中，可得測定的供試樣品溶液的總黃酮濃度(C)，再計算出樣品中的總黃酮提取率η：

式中：C為粗提取樣液中總黃酮的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數；M為山銀花粉末樣品質量，mg。

2.2 山銀花總黃酮工藝優化

2.2.1 單因素試驗設計

分別對影響山銀花總黃酮微波輔助提取過程中的 4 個因素(料液比(g/mL)、微波功率(W)、提取時間(min)和乙醇濃度(%))進行單因素實驗。

2.2.2 響應面試驗設計

在完成上述4種單因素實驗的基礎上，本實驗以料液比、微波功率、提取時間和乙醇濃度為自變因素，設計四因素三水平L9(34)的正交試驗，利用Design-Expert軟件進行響應面試驗設計和數據分析，進一步得出微波輔助法優化提取山銀花總黃酮的最佳工藝條件。響應面試驗設計因素水平見表 1。

表1 響應面試驗設計因素水平Table 1 The level of response surface test design factors

2.3 山銀花提取物的抑制α-葡萄糖苷酶研究

山銀花提取物的抑制α-葡萄糖苷酶酶活性及抑制動力學參照文獻[13-14]中方法選擇。

3 結果與討論

3.1 山銀花總黃酮的工藝優化

3.1.1 單因素試驗結果

山銀花單因素試驗結果見圖1。

圖1 山銀花總黃酮的單因素實驗Fig.1 Single factor experiment of total flavonoids in Lonicerae Flos

3.1.2 響應面試驗結果及方差分析

在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法優化輔助山銀花總黃酮的提取工藝。響應面試驗因素結果見表 2。利用 Design-Expert 軟件對實驗數據進行分析，得到二次多項回歸方程：

表2 響應面分析法結果Table 2 The results of response surface analysis

R=23.26+1.07A-0.415 8B+0.073 2C+0.070 3D-1.37AB-1.13AC-0.248 5AD-0.323 5BC+
0.082 0BD-0.965 0CD-2.42A2-0.785 4B2-0.988 6C2-0.632 6D2

其中：R為黃酮提取率；A，B，C和D分別為液料比、微波功率、提取時間和乙醇濃度。

由表3可知，對單因素來說，料液比、微波功率對總黃酮提取率影響比較差異均有統計學意義(P<0.05)，影響程度為A(料液比)>B(微波功率)>C(提取時間)>D(乙醇濃度)。

表3 回歸分析結果Table 3 The results of variance analysis

乙醇濃度、提取時間、料液比、微波功率交互作用對山銀花總黃酮提取率影響的響應曲面圖見圖2。對于交互作用來說，AB，AC，AD，BC以及CD的交互效應對總黃酮提取率的影響比較差異有統計學意義(P<0.05)，BD的交互效應對總黃酮提取率的影響比較差異無統計學意義(P>0.05)，但對于模型的二次項的影響比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 兩兩因素交互作用對山銀花總黃酮提取率影響的響應面圖Fig.2 Response surface map of the interaction of two factors on the extraction rate of total flavonoids from Lonicerae Flos

3.1.3 預測模型和方法驗證

用Design-Expert 12軟件得出山銀花總黃酮的最佳提取條件如下：料液比為1∶20.5 g/mL，時間為 8.0 min，乙醇體積分數為60.5%，功率為394 W，在此條件下模型預測的總黃酮提取率為 23.3%。根據實驗室條件以及模型預測結果確定微波最佳提取條件如下：料液比為1∶20.5 g/mL，提取時間為8 min，乙醇體積分數為 60%，微波功率為400 W，并在此提取條件下檢測響應面的最佳響應適宜性。實驗結果表明，山銀花總黃酮提取率為23.1%，與預測值的相對誤差為1.22%。這個實際山銀花總黃酮的提取率與所建立模型預測的山銀花總黃酮提取率相差不大，說明構建的模型是有效的。表明利用響應面法優化工藝條件準確可靠，且在實際操作中具備一定的可行性。

3.2 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的影響

3.2.1 山銀花總黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

糖尿病是一種可預防的代謝紊亂，其特征是血液中葡萄糖含量異常高，胰島素分泌失調[15]。α-葡萄糖苷酶是一種小腸消化酶，是人體內主要的代謝酶之一，能迅速降解膳食中的淀粉，導致血糖水平迅速升高[16]，目前，天然α-葡萄糖苷酶抑制劑研究得到廣泛關注。以阿卡波糖為對照，得到山銀花提取物對對α-葡萄糖苷酶的抑制作用結果見圖3。

圖3 阿卡波糖和山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.3 Inhibition of acarbose and Lonicerae Flos extract on α-glucosidase

3.2.2 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶抑制動力學分析

山銀花微波輔助醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制的Lineweaver-Burk曲線見圖4。文獻[17]最大反應速率Vmax減小，米氏常數Km增大，表4結果與此結果一致。由此推斷它對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為混合型抑制。

表4 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 4 Lineweaver Burk equation of inhibition of Lonicerae Flos extract on α -glucosidase

圖4 山銀花微波輔助醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver Burk curve of α-glucosidase inhibition by microwave-assisted ethanol extract of Lonicerae Flos

3.2.3 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光淬滅作用

熒光猝滅滴定法被廣泛應用于研究小分子與蛋白質的相互作用[18]。如圖5所示，小分子物質在α-葡萄糖苷酶熒光峰附近有熒光發射峰，隨著山銀花微波輔助醇提取物濃度增大，α-葡萄糖苷酶的熒光發射峰的強度逐漸降低，可以推斷山銀花微波輔助醇提取物與α-葡萄糖苷酶之間發生了相互作用。

圖5 在310 K下山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光作用Fig.5 Fluorescence of Lonicera Flos extract on α-glucosidase at 310 K

3.2.4 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅機理

根據式(1)Stern-volmer 方程，將山銀花微波輔助醇提取物濃度對F0/F作圖，結果見圖6。由圖6可知：F0/F與[Q]呈良好的線性關系。山銀花提取物與α-葡萄糖苷酶相互作用的 Stern-Volmer 方程參數見表5，可知隨著溫度升高，淬滅常數Ksv減小，從而可判斷山銀花波輔助醇提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光淬滅方式屬于靜態淬滅。

表5 山銀花提取物與α-葡萄糖苷酶相互作用的 Stern-Volmer 方程參數Table 5 Parameters of stern Volmer equation for interaction between Lonicera Flos extract and α-glucosidase

圖6 不同溫度下山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern Volmer plots for the fluorescence quenching of α-glucosidase by Lonicera Flos extract at different temperatures

(1)

式中：F0為熒光物質的初始熒光強度；F為相互作用后熒光物質的熒光強度；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數；Ksv為Stern-Volmer方程猝滅常數；τ0為猝滅劑不存在時，生物大分子的熒光平均壽命，一般為10-8s；[Q]為熒光淬滅劑濃度。

4 結論

采用微波輔助法提取山銀花總黃酮，并用響應面法優化其工藝條件，得到最佳工藝條件為料液比為1∶20.5 g/mL，時間為8.0 min，乙醇體積分數為60.5%，功率為394 W，該優選的工藝操作簡單，提取時間短，預測性強。山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，半數抑制濃度為378.44 mg/L，抑制效果低于陽性對照阿卡波糖(半數抑制濃度為200.10 mg/L)。山銀花提取物和α-葡萄糖苷酶的相互作用按照靜態淬滅進行，其抑制類型為混合型抑制。