枸杞多糖對大鼠視網膜光損傷的保護作用研究

韓樹梅,周 亮,王普升

光暴露所產生的光化學性損害導致視網膜組織學改變與視網膜變性類疾病中的萎縮性改變相似[1]。動物實驗表明，對實驗動物視網膜進行一定程度的連續光照射能夠引起視網膜光感受器細胞損傷。視網膜光損傷模型是研究視網膜變性類疾病的良好動物模型[2-3]。本研究通過建立大鼠光損傷動物模型，應用枸杞多糖在不同時間段給大鼠進行灌胃治療，通過記錄各組大鼠閃光視網膜電圖(F-ERG)，取材HE染色后應用光鏡觀察各組大鼠視網膜形態學的改變，測量視網膜外核層(ONL)厚度并進行統計學分析，探討枸杞多糖對大鼠視網膜光損傷的保護作用及其作用機理，從而為視網膜變性類疾病的預防和治療提供更多依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料:2020年11月-2021年4月在寧夏醫科大學動物中心選擇清潔級雄性Sprague-Dawley 大鼠48只，7～8周齡，體重200～250 g。隨機分為 4 組:正常對照組、模型組、模型+LBP治療(MLT)組、模型+LBP保護(MLP)組，NC組、M組每組6只大鼠，MLT組、MLP組每組18只大鼠。光損傷模型造模前均行眼前節檢查,排除眼部器質性病變。

1.2 實驗儀器及材料:采用RETIport(Roland Consult，德國)視覺電生理系統。

1.3 模型制備:自制光損傷箱,自制6面均裝有日光燈管的長、寬、高為1.5 m的光照箱，箱內照度經數字式光度計(上海師范大學)測定為4 180勒克斯,箱內溫度控制在22～25 ℃。所有實驗用大鼠造模前均在循環光環境下(12 h明以及12 h暗)適應7 d,對照組暗適應36 h[4]。實驗組在光照前暗適應36 h后,3%戊巴比妥溶液腹腔麻醉,以1%阿托品眼用凝膠滴眼散瞳，縫線開瞼,3只放入一個鼠籠(置有飲水設施)，待大白鼠清醒后,將鼠籠放入光照箱內,一個光照箱內可放入4只鼠籠，接受12 h持續光照射。光照射完畢后立即拆除眼瞼縫線后并送回暗環境下的飼養籠中飼養24 h后,重復以上模型制作過程,總計3次,光照射時間為36 h。

1.4 給藥方法

1.4.1 正常對照組：等量生理鹽水連續灌胃60 d。

1.4.2 模型組：造模成功后，等量生理鹽水連續灌胃60 d。

1.4.3 MLT組：造模成功后，立即給予不同劑量的枸杞多糖[400、600、800 mg/(kg·d )]連續灌胃60 d。

1.4.4 MLP組：在光損傷造模前，應用不同濃度的枸杞多糖溶液[400、600、800 mg/(kg·d)]連續灌胃60 d，在光損傷造模后，立即給予不同濃度的枸杞多糖溶液[400、600、800 mg/(kg·d)]連續灌胃60 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 閃光視網膜電圖記錄：光損傷模型造模成功后不同濃度的枸杞多糖溶液連續灌胃60 d后，對實驗大鼠按照常規方法記錄閃光視網膜電圖ERG 5項基本反應。

1.5.1.1 記錄參數：暗適應(Photopic)10.0反應、Photopic 0.01反應及Photopic 3.0反應；明適應3.0反應及明適應3.0 flicker 反應；閃光刺激光強為-25 dB(0.009 5 cds/m2),0.476 Hz;通頻帶 +/-1mV 1～300 Hz。

1.5.1.2 記錄方法：取暗適應12 h 的大鼠，稱重后使用3%戊巴比妥溶液予以腹腔麻醉，給予復方托吡卡胺滴眼液(美多麗)散瞳，5 min 1次，點3次，鹽酸奧布卡因滴眼液(丙美卡因)進行角膜表面麻醉。記錄電極為自制的直徑為3 mm的環形銀電極，固定于左眼角膜緣，應用1.5號針灸針制作的參考電極及接地電極，分別置于大鼠尾部皮下及被檢測眼的同側頰部。同法做右眼。進行暗適應ERG記錄。暗適應 ERG做完后，將實驗大鼠明適應10 min以后，再進行明適應3.0反應及明適應3.0 flicker 反應ERG的記錄[5]。

1.5.2 視網膜形態學觀察：ERG記錄后即摘取各組小鼠的右眼球,NC組、M組各6只，MLP組、MLT組各18只，每眼于角膜12：00角鞏膜緣處縫線定位標記,沿角膜緣環形切開眼球，去除玻璃體，甲醛固定帶有視網膜組織的這一部分眼球、逐級酒精脫水、石蠟包埋,平行于標記處至6點位的平面進行切片，固定距離視神經200 μm截面的切片進行 HE 染色，切片厚度約為5 μm,HE染色后應用光鏡進行形態學觀察。每個蠟塊的1個眼球從視神經向兩側每間隔20 μm做1次切片，每個蠟塊取3張切片的測量平均值作為1個樣本。測量視網膜外核層(ONL)的厚度[6]。

2 結果

2.1 SD大鼠閃光視網膜電圖:造模組、MLT組、MLP組暗適應10.0的a波、b波的幅值較正常對照組均明顯降低，b波幅值比較差異有統計學意義(P<0.05)；MLT組、MLP組b波幅值與模型組相比較高，差異有統計學意義(P<0.05)；暗適應10.0 MLT組的b波幅值與MLP組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；暗適應0.01造模組、MLT組、MLP組b波的幅值較正常對照組降低，差異有統計學意義(P<0.05)；MLT組、MLP組b波幅值與模型組相比較高，差異有統計學意義(P<0.05);暗適應0.01 MLT組的b波幅值與MLP組相比差異無統計學意義(P>0.05)。暗適應3.0反應，M組、MLT組、MLP組的b波波峰延遲出現，b波幅值與正常對照組對比均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；MLT組、MLP組b波幅值與模型組比較高，差異有統計學意義(P<0.05)；MLP組的b波幅值與MLT組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；造模組明適應3.0反應及3.0 flicker 反應波形未能完全引出，MLT組、MLP組明適應3.0反應的a波及b波幅值降低，b波幅值較正常對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)；MLP組b波幅值與MLT組相比較高，差異有統計學意義(P<0.05)；MLT組、MLP組3.0 flicker 反應的P1波幅值較正常對照組降低，具有統計學意義(P<0.05)。MLT組3.0 flickerP1波幅值與MLP組相比較低，差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 4組大鼠暗適應10.0、0.01、3.0 、明適應3.0 b波及3.0 flicker p1波幅值比較

2.2 視網膜組織學改變:光鏡下正常對照組大鼠視網膜 HE 染色后各層組織結構清晰、完整，染色均勻，清晰可見由內向外依次為神經節細胞層(GCL)、內叢狀層(IPL)、內核層(INL)以及外核層(ONL)，在內核層和外核層之間的一淡粉色著色的窄帶是外叢狀層(OPL)。神經節細胞呈單層排列，呈圓形或橢圓形，細胞大小不一；內核層及外核層的細胞呈多層分布，細胞核密集分布，外核層的細胞核層更多、更密集 。根據實驗設計，光損傷誘導光感受器細胞變性凋亡、視網膜萎縮的情況，我們成功制成大鼠光損傷視網膜變性模型，取材固定、包埋HE染色后，從形態學角度分析光感受器細胞(視錐細胞和視桿細胞)的存活情況，光鏡下觀察視網膜結構，分析視網膜內層、外層結構層次的變化，可見造模組光感受器細胞減少，外核層變薄，且視細胞內節(IS)和外節(OS)結構紊亂，IS/OS層變薄。模型組GCL減少，部分細胞核結構未見，核固縮濃染，以內核層和外核層損傷最為明顯，內核層和外核層明顯變薄，內核層是由水平細胞，無長突細胞，雙極細胞的細胞核構成，MLP、MLT組ONL損傷較模型組有所好轉，見圖1(目錄后)。

2.3 各組大鼠視網膜外核層厚度的柱形圖分析與比較:模型組、MLT組、MLP組較正常對照組的視網膜外核層厚度均明顯變薄，差異有統計學意義(P<0.05)；MLT組、MLP組與模型組比較，視網膜外核層厚度大，差異有統計學意義(P<0.05);MLP組與MLT組比較，視網膜外核層厚度大，差異有統計學意義(F=26.56，P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠視網膜ONL厚度比較

3 討論

由光污染造成的視網膜光損傷也越來越普遍，如激光損傷黃斑區光感受器、電焊工人的視網膜受損以及長時間熬夜玩手機等均可引起視力下降。光損傷會導致視網膜光感器細胞不同程度的受損，形成視網膜光損傷，臨床表現為在黃斑OCT可見中心凹處IS/OS光帶的結構紊亂、水腫，甚至是斷裂；光感受器細胞(視錐細胞和視桿細胞)的內側部分核周體形成外核層，外側部分核周體構成視錐細胞和視桿細胞的內節(IS)和外節(OS)[7]。2018年全國愛眼日的主題是“關注眼健康，預防光污染”，目前各類電子產品的大量使用，不同波長的激光廣泛應用于科學領域，家庭中各類裝飾燈具以及商場中的各式各樣的燈具都是光污染的來源，這一問題不僅是醫學界的難題，也成為嚴峻的社會問題，光污染這個話題越來越受到眼科醫生的重視。

枸杞多糖是從寧夏的特色植物枸杞中分離出的主要多糖之一。大量文獻報道，枸杞多糖具有抗輻射、防衰老、抗氧化等多種生物學活性，尤其是急性高眼壓對視網膜的損傷、糖尿病視網膜病變等疾病具有保護作用[8-9]。在《本草綱目》里枸杞有明目的記載，但其機制尚不清楚。本研究通過建立大鼠光損傷動物模型來研究枸杞多糖對視網膜光損傷的保護作用及其作用機理，結果發現大鼠視網膜通過長時間的日光燈照射后，視網膜的神經細胞層薄變，部分神經細胞胞漿空泡狀、液化，部分細胞核固縮、溶解，視網膜的內核層變薄，外層視網膜結構當中的外核層及IS/OS層均有不同程度的薄變；視電生理的結果顯示，光損傷模型后，造模組暗適應10.0、0.01、3.0反應中的b波幅值較正常對照組均明顯降低，差異具有統計學意義。應用枸杞多糖進行干預后MLT組及MLP組暗適應10.0、0.01、3.0反應中的b波幅值較正常對照組是降低的，但較造模組有好轉；明適應3.0反應及3.0 flicker反應波形造模組未能完全引出，MLT組、MLP組明適應3.0反應的a波及b波幅值降低，波峰延遲出現，3.0 flicker 反應的N1及P1波幅值降低，與正常對照組比較b波幅值高，差異具有顯著性，說明視網膜光損傷后應用枸杞多糖治療有效，視網膜功能有不同程度的恢復。造模組、MLT組、MLP組3組視網膜電圖暗適應10.0、0.01、3.0反應中反應波幅值均降低，波峰延遲出現；造模組明適應3.0反應及3.0 flicker 反應波形未能完全引出，這表明了光損傷模型的成功及視網膜光損傷的確定性。視電生理的各項視網膜電圖作為評判視網膜功能的主要檢查手段[5]，已經被廣泛應用于動物實驗當中，從此項研究視網膜電圖的結果分析可發現在大鼠視網膜光損傷模型中，大鼠的視網膜功能嚴重受損，應用枸杞多糖干預治療的MLT組、MLP組的各項閃光視網膜電圖結果較造模組要好，同時造模前后均使用枸杞多糖干預的MLP組在明適應3.0及3.0 flicker反應波形幅值的降低程度較單純造模后應用枸杞多糖的MLP組要低，差異有統計學意義，但是在暗適應10.0、0.01、3.0中未見明顯差異，提示枸杞多糖對視桿細胞的修護作用強于視錐細胞，還需要進一步研究。病理學檢查結果顯示，MLT組、MLP組視網膜外核層的厚度較正常對照組依然是下降的，但較造模組要高，差異有統計意義(P<0.05)。MLP組視網膜外核層的厚度較MLT組明顯增高的，差異有統計意義(P<0.05)，這與視電生理檢查結果相符，表明同時在光損傷前提早進行枸杞多糖干預治療，更有利于預防、保護視網膜受損以及加強視網膜受損傷后的修護。

本研究結果提示，光污染會嚴重影響視網膜的代謝，可造成視網膜IS/OS帶結構的紊亂、水腫，甚至是斷裂，嚴重影響視力。具有一定強度的可見光長時間的照射眼睛，依然會影響到視網膜的代謝，視網膜光感受器細胞凋亡，視網膜外層甚至是全層的變??；而枸杞多糖可以保護和治療視網膜光損傷，減少視網膜光感受器的凋亡，在視網膜光損傷前，提早用枸杞多糖的干預比單純光損傷后的應用效果更好，這就為視網膜光損傷以及視網膜變性類疾病的治療提供了一定依據。