廈門地區兒童流感嗜血桿菌流行特點及耐藥性分析

王金輝 陳 雷 黃美戀 莊鴻源

廈門市兒童醫院檢驗科，福建廈門 361006

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，HI）是引起兒童呼吸道感染的常見病原菌，是兒童社區獲得性肺炎的重要病原體，可引起肺炎、支氣管炎、化膿性腦膜炎、膿毒血癥等多種疾病，嚴重威脅兒童的身體健康[1]。近年來，臨床抗生素的廣泛使用，使流感嗜血桿菌的耐藥性逐年增加，臨床治療難度越來越大[2]。本課題組分析了2019年1—12月廈門市兒童醫院呼吸道感染就診患兒的流感嗜血桿菌流行情況，并對痰液標本培養分離出的流感嗜血桿菌的耐藥情況及β-內酰胺酶基因進行分型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2019年1—12月廈門市兒童醫院呼吸道感染患兒的痰液標本31 163份，經培養后使用德國BRUKER MALDI TOP微生物快速鑒定系統進行菌種鑒定。

1.2 主要儀器和試劑

微生物快速鑒定系統（德國BRUKER公司，BRUKER MALDI TOP）；嗜血桿菌屬培養基（HTM）平板（美國BD公司）；藥敏試驗鑒定儀（法國梅里埃公司，VITEK 2 Compact）；頭孢硝噻吩紙片（中國龐通醫療公司）；PCR擴增儀（美國ABI公司7500型）。

1.3 β-內酰胺酶表型檢測

用頭孢硝噻吩紙片法，按照試劑說明書操作：用無菌去離子水浸濕紙片，沾取少量待測菌菌落到紙片表面。紅色出現為陽性結果，即細菌產β-內酰胺酶；1 h后無顏色改變為陰性，即細菌不產β-內酰胺酶。

1.4 β-內酰胺酶基因分型

采用煮沸法提取流感嗜血桿菌DNA：取流感嗜血桿菌混勻于0.5 ml生理鹽水中，濃度高于1麥氏濁度單位，懸液于100℃ 10 min，冷卻后13 800 g 離心1 min，取上清液，-20℃保存。流感嗜血桿菌β-內酰胺酶TEM-1和ROB-1基因引物、PCR擴增條件和β-內酰胺酶基因分型方法見參考文獻[3-4]。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴增反應體系 50 μl，包括 10 mmol/L dNTP 4 μl，10×buffer 5 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，上、下游引物（20 μmol/L）各 1 μl，DNA 模板 2.5 μl，ddH2O 35.5 μl。擴增條件：94℃ 10 min；94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 45 s，30 個循環；72℃ 10 min。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。部分PCR擴增產物送上海生工生物工程公司測序，測序結果在GeneBank數據庫中網上查詢比較，進行Blast比對分析。

1.5 統計學分析

使用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以%表示，組間差異使用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。使用WHONET 5.5軟件進行細菌耐藥性分析。

2 結果

2.1 流感嗜血桿菌檢出率及不同年齡段的分布情況

2019年共收到31 163份痰標本，經培養后，其中3491份標本陽性。經鑒定檢出HI陽性標本841株，占陽性標本的24.09%。不同的年齡段分布情況如下：＜1歲的嬰幼兒占比28.15%，幼兒期（1～＜3歲）占28.10%；學齡前期（3～7歲）占18.82%；學齡期（＞7歲）占5.46%，見表1。

表1 2019年兒童痰液標本流感嗜血桿菌的檢出率及不同年齡段的分布情況

2.2 流感嗜血桿菌的季節分布情況

2019年共841株HI臨床株，第一季度檢出364株（43.28%），第二季度檢出303株（36.03%），第三季度檢出61株（7.25%），第四季度檢出113株（13.44%）。

2.3 流感嗜血桿菌的耐藥情況分析

2019年檢出流感嗜血桿菌的對抗菌藥物的耐藥情況見表2、圖1，841株HI陽性菌株的藥敏實驗結果見表2。其中復方磺胺甲噁唑的耐藥率最高為74.78%，氯霉素的耐藥率最低為3.18%。同時課題組查閱了www.chinets.com網站數據，將2019年廈門市兒童醫院流感嗜血桿菌的耐藥情況與同年CHINET公布的流感嗜血桿菌（兒童）數據進行比較，除氨芐西林/舒巴坦組外，各組的耐藥率與CHINET的數據差異無統計學意義。而氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為3.57%，與2019年CHINET數據（32.8%）比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 2019年流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥情況且與2019年CHINET數據比較

圖1 2019年廈門市兒童醫院流感嗜血桿菌耐藥情況與2019年CHINET數據比較

2.4 流感嗜血桿菌β-內酰胺酶表型結果及基因分析

841株流感嗜血桿菌β-內酰胺酶檢出率為41.85%（352/841），檢測到β-內酰胺酶基因與頭孢硝噻吩紙片法結果一致。β-內酰胺酶的基因型均為TEM-1型，見圖2。

圖2 流感嗜血桿菌TEM-1型和ROB-1型內酰胺酶基因擴增產物電泳圖

3 討論

流感嗜血桿菌是兒童發生社區獲得性肺炎的重要病原體，基于鑒定條件及耐藥機制的復雜性，HI的分布和耐藥性具有地域性差異[5-6]。本課題組對2019年廈門市兒童醫院呼吸道感染患兒的痰液標本分離出的HI進行分析，HI的檢出率占總檢出率的24.09%，2019年CHINET官網（www.chinets.com）的數據顯示在101 714份呼吸道標本中，HI在的分離率為8.92%，我院2019年的分離率遠高于CHINET統計數據[7]。兒童的呼吸道標本中，分離出的細菌種類與成人細菌種類分布不同，兒童以肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、奈瑟卡他菌為主[8]。本課題組統計2019年HI高于CHINET的統計數據，這與兒童醫院?？铺攸c相關，符合兒童呼吸道細菌陽性分布的特點[9]。

在不同年齡分布情況顯示，＜3歲幼兒的HI陽性的檢出率高于3歲以上兒童的檢出率，而≤1歲和1～3歲年齡組的檢出率相似，分別為28.15%和28.10%，高于其他年齡段，這可能由于幼兒期免疫系統尚未發育健全，肺清除能力不足，使流感嗜血桿菌的定植概率增加所致[10]。季節分布結果顯示一、二季度流感嗜血桿菌的檢出率高于三、四季度，與汪倩鈺等[11]報道的2016—2018年兒童呼吸道感染病原譜中的結果相一致。廈門地區一、二季度氣溫相對較低且潮濕，冷熱交替，且早晚溫差大，因此容易出現流感嗜血桿菌感染相關的呼吸系統疾病。

兒童革蘭陰性桿菌感染的主要菌群是流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌。流感嗜血桿菌的藥敏試驗顯示對復方新諾明、氨芐西林的耐藥率較高，這一點與陳姍姍等[12]報道的山西省兒童醫院流感嗜血桿菌的分布及耐藥情況分析相一致。本課題組對流感嗜血桿菌的耐藥性進行了分析，本研究藥敏結果顯示，HI對復方磺胺甲噁唑的耐藥率最高為74.78%，略高于CHINET的數據（70.4%），其耐藥機制主要是染色體介導的二氫葉酸還原酶過量產生，導致與甲基芐氧嘧啶的結合減少所致[13]。對氨芐西林的耐藥率為62.34%，低于2019年CHINET的數據（71.1%）；而氨芐西林和阿莫西林是治療感染常用的藥物，但由于HI的耐藥率逐年升高，不宜作為臨床經驗用藥[14]。

本課題組對流感嗜血桿菌的β-內酰胺酶的檢出率為41.85%，提示本地區產β-內酰胺酶是導致HI對氨芐西林耐藥的主要機制。同時對其基因型進行檢測，發現絕大部分是TEM-1型，水解氨芐西林使其失活，此結果與秦惠宏等[15]的報道一致。本課題組發現氨芐西林/舒巴坦的耐藥率我院為3.57%，遠低于CHINET的數據（32.8%），差異有統計學意義（P＜0.05）。氨芐西林/舒巴坦聯合應用，不僅可保護β-內酰胺類抗生素（氨芐西林）免收酶的水解破壞，增強其抗菌作用，而且還擴大了抗菌譜，增強了抗菌活性，具有廣譜、耐酶的特點。因此臨床可選擇氨芐西林/舒巴坦治療因流感嗜血桿菌引起的呼吸道感染。我院的結果與CHINET的數據有差異，可能有兩方面原因：一是CHINET數據包括全國不同地區綜合醫院和兒童醫院的數據，數據來源寬泛；二是細菌耐藥的分布具有年齡和地域的差異，在廈門地區兒童HI對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率低，具有地域特色[16]。

綜上所述，HI是兒童呼吸道感染的重要病原體，3歲以下的嬰幼兒是易感人群，感染率與氣候相關，冬季是高發季節，且產β-內酰胺酶的HI比例較高，應根據藥敏結果選擇藥物進行治療。