實時熒光定量PCR實驗中常見的幾個關鍵注意事項

周愛軍 程澤影

近年，從科學研究到臨床檢測，從“非洲豬瘟”的檢測到“新冠病毒”的檢測，熒光定量PCR儀器已成為分子生物學研究的常規設備。檢測方法的迅速發展，檢測任務的緊急也對檢測人員提出了更高的要求，需要他們具備熟練操作能力和分析判斷數據結果的能力。對于熒光定量PCR結果，最直觀的判斷就是看CT值和擴增曲線是否正常。很多人在平時實驗中會遇到異常擴增曲線的困擾，比如，核酸污染風險引起樣本陽性、打折的擴增曲線、復孔間重復性不好和陰性樣本擴增曲線抬升等。面對異常的擴增曲線，筆者將從以下幾個實例分析比較常見的異常擴增曲線產生的原因及其解決辦法。

一、確定是否有核酸污染風險的存在

由于在實驗過程中，容易產生氣溶膠，造成樣本陽性，所以要做好設施和環境的消毒處理。

（一）有效消毒劑的選擇

消毒劑包括鄰苯基苯酚、次氯酸鹽、強堿類及戊二醛等。我們要根據不同的需要來選擇，如堿類（氫氧化鈉、氫氧化鉀等）、氯化物和酚化合物適用于建筑物、木質結構、水泥表面、設施設備的消毒，而酒精和碘化物適用于人員消毒。消毒劑必須有效，如“非洲豬瘟”病毒，用0.8% 氫氧化鈉、含 2.3% 有效氯的次氯酸鹽、0.3%福爾馬林溶液、3%鄰苯基苯酚和3%碘化合物，處理 30 min即可將其殺滅。

（二）儀器設備和環境的消毒

1.生物安全柜內消毒。如進行“非洲豬瘟”檢測活動時應在生物安全柜中操作區鋪隔水墊，實驗后卷起隔水墊置于污物桶后消毒滅菌，采用有效消毒劑將生物安全柜內操作區消毒處理1遍，再用清水浸泡紗布或吸水紙清洗1～2 遍。

2.剪刀、鑷子等可重復使用物品消毒。剪刀、鑷子等可高壓滅菌的物品直接置于銳器盒高壓滅菌處理。不能高壓滅菌的物品考慮消毒劑浸泡，可用塑料盒盛裝有效消毒劑進行浸泡處理 30 min。不能用消毒劑浸泡但可高壓處理的，可放進生物安全滅菌袋后直接高壓蒸汽消毒（121 ℃，30 min）。

3.儀器、工作臺面、地面、環境消毒。消毒的頻次可根據做實驗次數的多少來定，少時14 d消毒1次，多時7 d消毒1次?？捎米贤饩€燈消毒30～60 min，但紫外線燈用久后不能起到殺滅微生物的效果，所以實驗結束后，儀器、工作臺面、地面、環境均應用消毒液噴灑擦拭消毒。對金屬儀器等消毒時應防止對儀器的腐蝕。實驗過程中若出現樣品溢灑或容器破碎等情況，發生小量液體樣品溢灑時，應用吸水紙吸干，然后在表面噴灑有效消毒劑進行處理。發生大量液體樣品溢灑時，應該立即用毛巾或紙巾覆蓋感染性物質及相關破碎物品，然后在上面噴灑有效消毒劑，消毒30 min。再對吸水毛巾或紙巾以及破碎物品進行清理（玻璃碎片應用鑷子清理），然后再用有效消毒劑噴灑或擦拭污染區域。清理完畢后，應對清潔用具及垃圾進行高壓滅菌。檢驗人員在整個操作過程中應佩戴手套。清理操作區域及環境消毒完畢后，如水分蒸發導致臺面、內壁等出現白色結晶現象，應采用蒸餾水噴灑擦拭清理干凈。另外，還要開負壓空氣過濾裝置，保持實驗室潔凈。

二、確定熒光定量PCR儀操作軟件設置的正確與否

實驗前檢驗員要對照試劑盒說明書，檢查熒光PCR儀設置的加熱時間、保持的溫度、循環的次數、熒光信號的采集和通道等是否與試劑盒說明書設置的要求一致。有一個比較容易忽略的設置問題是需要看一下所選用的試劑中是否含有ROX來作為參比熒光染料。有的熒光定量PCR 儀可以用ROX來作為參比熒光染料，用以校正儀器系統以外的物理誤差。例如，均一化的校正作用，由于移液誤差或者蒸發導致的一批熒光反應管內的體積誤差等。目前，市面上有的熒光定量PCR試劑盒預混液是不含有ROX參比熒光染料的，如果用此類試劑盒時，應將ROX參比功能關閉，否則可能會出現圍繞基線上下波動的“鋸齒狀”擴增曲線。遇到這種問題，可以在“菜單設置”中找到“參比熒光染料”功能，將ROX改為None，重新將樣本加入含熒光反應液和聚合酶的反應體系中重新進行擴增分析，結果就正常了。切記不要將原來的反應管重新進行擴增1次，如果這樣，擴增曲線是一條直線，結果呈陰性，從而造成檢驗結果的錯誤。有的熒光定量PCR 儀默認是對所有熒光通道及所有樣品孔進行熒光采集，用戶不用害怕數據丟失，實驗結束后，可對儀器設置錯誤的反應孔的熒光通道、樣品名稱等進行更改，結果就會顯示出正確的擴增曲線。

還有可能出現其他一些異常結果。如多組分圖擴增曲線沒有抬升，本應是很明顯的陰性樣本，但是擴增圖譜的擴增曲線抬升了，這樣抬升曲線就會與閾值線相交，反而出現了CT值。這主要是由于軟件在進行基線自動扣除的時候出現了錯誤，引起了擴增曲線的抬升。出現這種情況首先可采取手動調整基線的方法，重新定義基線就可恢復正常。即將基線起點改為熒光信號穩定的循環數（一般是3）;基線終點則改成擴增曲線起峰的前一個循環數（比如起峰是在第25個循環，那基線的終點就是24）。另外，引起這種現象發生的原因是所選耗材、試劑或者操作導致背景熒光信號有所波動，從而造成反應孔的自動基線扣除錯誤，導致擴增曲線的抬升。

三、確定耗材和儀器配件是否使用正確

耗材對于熒光定量PCR來說非常重要，很多異常的擴增曲線是由于耗材使用不當引起的。

（一）錯誤使用普通PCR儀器所對應的耗材

普通PCR耗材一般透光性不均勻，會造成熒光透過比較薄的地方，熒光信號強;透過比較厚的地

方，熒光信號弱。這樣會導致擴增熒光信號曲線時而上抬、時而下降的異常變動，從而出現擴增曲線打折的現象。

（二）未選擇跟儀器加熱模塊規格相匹配的耗材

有的熒光定量PCR 儀加熱模塊分為兩種，實驗前一定要確定好自己的儀器是哪一種加熱模塊，再來選擇相對應的實驗耗材。如果小的加熱模塊使用較大的耗材，則會造成耗材壓扁，甚至造成機器出現故障并出現報警的現象;如果大的加熱模塊使用較小的耗材，則會造成反應管的外壁和熒光定量PCR儀的溫控模塊沒有充分接觸，從而出現熱傳導不充分，進而影響聚合酶的活性，結果會引起同一個檢測樣本重復性不好，或者出現非特異擴增（溶解曲線多峰）現象，有的甚至出現假陰性的結果。

（三）使用了質量比較差的耗材

大部分熒光定量PCR儀器是一個開放的平臺，客戶可以使用開放的試劑、開放的耗材。但是目前市面上熒光定量PCR耗材種類繁多，質量也是千差萬別。在耗材選擇上，盡量選擇一些名牌企業的優質產品，不要因為便宜選用質量差或不符合要求的實驗耗材，帶來不必要的實驗錯誤。例如，使用質量不好的耗材可能會引起熒光值不穩定，從而造成反應孔的自動基線扣除錯誤，得到不準確的CT值;使用質量好的耗材，熒光信號正常，會出現明顯指數增長曲線和CT值。如果使用PCR封膜質量不好的反應管，在PCR擴增加熱過程中又受到蒸發的熱水蒸氣的影響，容易產生變形，這樣會引起“熒光的折射”，即“光學扭曲”現象。該實驗如果使用了ROX作為參比熒光染料，ROX就會有效地校正這種熒光信號偏差，出現均勻的擴增曲線，其結果才是正常的。

四、確定所使用的試劑是否正常

如果無核酸污染風險的存在、軟件設置都正確、實驗耗材及配件也沒有問題，但是擴增曲線還是異常，這個時候就要確定所用試劑是否正常。

（一）確定試劑是否有效

確定試劑是否有效，包括查看試劑是否在有效期內，是否反復凍融多次，運輸條件是否正常?？梢酝ㄟ^比較試劑的批次號，結合實驗中的陽性、陰性對照結果，若陰性對照出現非特異性起跳，要先結合同一陰性對照的多組分圖，看看是否有擴增曲線;如果是由于背景熒光波動導致基線自動扣除錯誤導致的起跳，可通過手動調整基線的方式進行更改。如果是染料法實時熒光定量PCR實驗，可以通過溶解曲線來判斷是污染，還是引物二聚體;如果是探針法實時熒光定量PCR實驗，則可能是污染導致的起跳。只有陽性、陰性對照結果正確，才能確定試劑的有效性。

（二）觀察擴增后的試劑體積

如果在擴增過程中試劑中的水分蒸發，可能會引起擴增體系中擴增物質濃度增高，在發射光源的照射下，熒光信號增強（熒光信號的強度與擴增物濃度呈正相關），出現熒光擴增曲線抬升的現象。如果實驗體系中加入了ROX作為參比熒光對照，ROX參比熒光染料可以區分擴增曲線抬升是真擴增，還是試劑蒸發引起的擴增。如果參比熒光物質的反應管沒蓋好或者使用了PCR封膜質量不好的反應管，就會造成ROX反應體系有蒸發和水分丟失的現象，ROX參比熒光染料的濃度會逐漸地增加，結果就出現ROX參比熒光擴增曲線抬升現象，而正?？字蠷OX熒光會一直不變。所以在做PCR實驗加完試劑上機擴增時，一定要檢查PCR反應管是否已經蓋好并且密封嚴實。這樣既防止試劑蒸發影響檢測結果，又防止試劑蒸發形成氣溶膠。

五、確定實驗過程中的操作細節是否有誤

如果以上都正常，還要注意實驗過程中的操作細節。例如，在做標準曲線的時候，是不是梯度稀釋的標準品，如果不是梯度稀釋的標準品，可能會引起標準曲線擴增的效率或者R2值的異常。從冰箱冷凍室中取出的試劑是不均勻的，如果試劑融化后沒有混勻，這時候取出的試劑是不均勻的，會影響后面的擴增。定量PCR預混液跟核酸模板加好后是否混勻，如果沒有混勻，特別是樣本體積比較大的時候（超過PCR反應體系的20%），更容易發生“光波混頻”現象。因為核酸樣本是水相，會在反應體系的上層;試劑含有甘油等成分，會在下層。在前期的PCR擴增過程中不足以完全混勻，這樣會形成熒光信號的折射，這時發出的熒光信號較強，就會出現擴增曲線向上抬的現象。再繼續加熱和降溫進行幾個循環后，由于液體分子的熱運動加快，很快樣本跟預混液混勻，熒光就會穩定了。