基于網絡藥理學和分子對接探討強力定眩片治療高血壓的作用機制

林建國 張津菊 段錦龍 姚魁武

摘要 目的：基于網絡藥理學和分子對接技術，探討強力定眩片治療高血壓的作用機制。方法：使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、中藥分子作用機制的網絡藥理學在線分析工具（BATMAN-TCM）平臺檢索強力定眩片活性成分，使用Swiss Target Prediction數據庫，對活性成分進行靶點預測。通過GeneCards、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）、治療靶點數據庫（TTD）得到高血壓相關靶點，整合藥物靶點和疾病靶點，獲取交集靶點。使用Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖，篩選核心成分。利用STRING平臺構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，篩選核心蛋白。使用MCODE對PPI網絡進行蛋白聚類分析。利用DAVID數據庫進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，Hiplot分析平臺進行基因本體（GO）富集分析，再使用Autodock Vina和Pymol實現核心成分-核心蛋白的分子對接。結果：檢索得到強力定眩片活性成分44個，作用靶點679個，疾病相關靶點2 367個，藥物與疾病的交集靶點305個。KEGG分析顯示，交集基因主要富集于PI3K-AKT信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、HIF-1等信號通路。GO富集分析顯示，交集基因主要富集于循環系統調控過程、血管管徑調節、MAPK級聯正向調節、血壓調節等過程。分子對接結果顯示，主要核心成分與核心蛋白均有較好的結合活性。結論：強力定眩片可能通過調控腎素-血管緊張素-醛固酮系統、血管平滑肌收縮、氧化應激、鈣離子通道等方式，起到降低血壓的功效。

關鍵詞 強力定眩片;高血壓;網絡藥理學;分子對接;作用機制

Study on the Mechanism of Qianglidingxuan Tablets in the Treatment of Hypertension Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

LIN Jianguo，ZHANG Jinju，DUAN Jinlong，YAO Kuiwu

（Guang′anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Qiangli Dingxuan Tablets in the treatment of hypertension based on network pharmacology and molecular docking.Methods：Active components of Qiangli Dingxuan Tablets were searched by TCMSP and BATMAN-TCM，and the target prediction of the active components was made by Swiss Target Prediction database.Hypertension-related targets were obtained through GeneCards，OMIM and TTD databases，and drug targets and disease targets were integrated to obtain intersection targets.Cytoscape software was used to construct the drug-active ingredient-action target-disease network diagram and screen the core components.STRING platform was used to construct the PPI network and screen the core proteins.MCODE was used to perform protein clustering analysis of PPI network.DAVID database was used to analyze the enrichment of KEGG pathway.GO enrichment analysis was carried out by using Hiplot analysis platform.Autodock Vina and Pymol were used to realize the molecular docking of core component-core protein.Results：A total of 44 active components，679 action targets，2367 disease-related targets and 305 drug-disease intersection targets were retrieved.KEGG analysis showed that the overlapping genes were mainly concentrated in PI3K-AKT signal pathway，Ras signal pathway，Rap1 signal pathway，calcium signal pathway，cAMP signal pathway，HIF-1 and other signal pathways.GO analysis showed that the overlapping genes were mainly concentrated in the regulation of circulatory system，the regulation of vascular diameter，the positive regulation of MAPK cascade，the regulation of blood pressure and so on.The results of molecular docking showed that the main core components and core proteins had good binding activity.Conclusion：Qiangli Dingxuan Tablets may play a role in lowering blood pressure by regulating and controlling renin-angiotensin-aldosterone system，vascular smooth muscle contraction，oxidative stress，calcium channel and other systems.

Keywords Qiangli Dingxuan Tablets; Hypertension; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.009

高血壓是最常見的慢性疾病，根據2012—2015年全國高血壓調查研究發現，我國18歲及以上成年人高血壓患病率為23.2%，正常高值患病率為41.3%，呈逐年遞增趨勢[1]。血壓水平與心血管風險正相關，通過降低血壓，可有效預防或延遲腦卒中、心肌梗死、心力衰竭、腎功能不全等疾病的發生[2-3]。臨床治療高血壓通常是服用西藥長期治療，但這常伴隨患者依從性降低，社會經濟負擔加重，不良反應風險加大等問題[4-5]。

高血壓屬于中醫“眩暈”“頭痛”等范疇，主要病機為肝腎陰陽平衡失調，病理因素為風、火、痰、瘀[6]。中醫藥治療高血壓具有全方位、多途徑、整體調節的優點。中成藥強力定眩片由天麻、杜仲、野菊花、杜仲葉、川芎5味中藥組成，具有降壓、降脂、定眩之功效。方中杜仲補肝腎，強筋骨，可治肝腎虧虛之本;天麻息風止痙，平抑肝陽，可除眩暈之證;川芎活血行氣，祛風止痛，具有疏通血脈之效;野菊花疏風散熱，解毒明目，可折亢陽?，F代藥理研究證實強力定眩片主要成分杜仲、天麻具有調節動脈血管、抗血小板聚集、改善血流動力學等藥理作用[7-8]，臨床治療高血壓及其并發癥有較好療效[9-10]。由于中藥復方存在多靶點、多途徑等特點，具體作用機制不明確，因此，本研究借用網絡藥理學的方法，對強力定眩片的有效成分、治療靶點、信號通路加以預測，為后續臨床應用和基礎研究提供參考。流程見圖1。

1 資料與方法

1.1 活性成分及作用靶點的收集 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中藥分子作用機制的網絡藥理學在線分析工具（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM），搜索天麻、杜仲、野菊花、杜仲葉、川芎的活性成分，TCMSP篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18，BATMAN-TCM篩選條件為Score≥20。之后通過Swiss Target Prediction數據庫，對活性成分進行靶點預測，得到作用靶點。

1.2 高血壓靶點的收集 通過GeneCards數據庫、在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數據庫和治療靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）以“hypertension”為檢索詞進行檢索，篩選收集高血壓相關基因靶點，并將3個疾病數據庫的結果進行匯總。

1.3 藥物-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖的繪制? 對作用靶點和疾病靶點取交集，獲得交集靶點。利用Cytoscape軟件繪制藥物-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖，使用Network Analyzer分析功能和cytoHubba插件篩選出核心活性成分。

1.4 核心蛋白的收集 通過STRING平臺對交集靶點進行蛋白質-蛋白質相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網絡繪制，將PPI信息導入Cytoscape中，篩選出核心蛋白，同時利用MCODE插件對PPI進行功能模塊化聚類處理。

1.5 基因的富集分析 使用DAVID數據庫和Hiplot分析平臺對交集靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析和基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析中的生物過程（Biological Process，BP）分析，篩選出主要的KEGG通路和BP條目。

1.6 分子對接 將篩選出的核心活性成分和核心蛋白進行分子對接，驗證其相互作用強度?；钚猿煞纸Y構通過PubChem數據庫獲取，蛋白質結構通過蛋白質結構數據庫（Protein Data Bank，PDB）獲取。使用AutoDock Vina軟件進行分子對接，借助Pymol軟件對分子對接結果進行優化制圖。

2 結果

2.1 強力定眩片靶點 通過TCMSP平臺，BATMAN-TCM數據庫，收集到活性成分44個，其中杜仲20個、杜仲葉2個、川芎6個、天麻9個、野菊花7個，共有成分3個，分別為Beta-sitosterol、Kaempferol、Quercetin。通過Swiss Target Prediction數據庫得到作用靶點679個。

2.2 高血壓靶點 以“Hypertension”為檢索詞進行高血壓相關靶點的收集，將3個疾病數據庫基因結果進行歸納，其中GeneCards數據庫2 336個基因（Relevance Score≥5），TTD數據庫107個基因，OMIM數據庫66個基因，刪除重復基因得到2 367個疾病基因。對疾病靶點與藥物作用靶點映射取交集，得到二者交集靶點305個。見圖2。

2.3 藥物-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖 通過Cytoscape繪制藥物-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖。采用Network Analyzer計算分析得到352個節點，1 603條邊，平均度值為9.1。使用cytoHubba插件根據度值篩選前20位的活性成分，其中主要化合物Quercetin、Kaempferol、Acacetin、Syringetin、Luteolin、Dehydrodieugenol、Beta-sitosterol、分別與56、56、62、60、56、55、26個靶點相連，且多為黃酮類化合物。ACHE、CA1、ALOX5、CYP19A1、CA2、ADORA1、AKR1B1、ADORA2A、ESR2、CDK2為度值前10的靶點蛋白，均與≥10個活性成分相連。見圖3，表1。

2.4 核心蛋白PPI網絡圖 共得到304個節點，513條邊，平均度值33.76。根據度值篩選前20的蛋白，使用MCODE插件對PPI網絡進行蛋白聚類分析，構建功能模塊，得到12個蛋白聚類群;根據score值排序，對前4個模塊進行BP富集分析，其中模塊一涉及血管調節、細胞內鈣離子濃度的正調控、G蛋白偶聯受體信號通路、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路等過程;模塊二涉及磷脂酶C活性的正調控、平滑肌細胞增殖的正向調控、細胞對脂多糖的反應、MAPK的正調控等過程;模塊三涉及三酰甘油分解過程、膽固醇平衡、脂肪酸氧化、長鏈脂肪酸運輸等過程;模塊四涉及腺苷酸環化酶活性的激活，去甲腎上腺素的血管舒張作用，腎上腺素參與調節全身動脈血壓、人體溫度的調節等過程。見表2，圖4。

2.5 GO富集與KEGG富集分析 使用DAVID數據庫對交集基因進行KEGG富集分析得到115個KEGG分析條目。對排名前15的通路其進行氣泡圖繪制，結果顯示：基因主要富集于PI3K-AKT信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、HIF-1等信號通路。使用Hiplot在線分析平臺對交集靶點進行BP分析，結果顯示：交集基因主要富集于循環系統調控過程、血液循環過程、血管管徑調節、MAPK級聯正向調節，血壓的調節等過程。見圖5～6。

2.6 分子對接 利用AutoDock軟件將度值最高的7個活性成分Quercetin、Kaempferol、Acacetin、Syringetin、Luteolin、Dehydrodieugenol、β-sitosterol與6個核心蛋白AKT1、ALB、VEGFA、TNF、EGFR、SRC進行分子對接，配體和受體二者結合越穩定，結合能就越低，結合能≤-5 kcal/mol，說明二者結合較穩定。結果顯示：結合能均≤-6 kcal/mol，其中對接最穩定的為β-sitosterol與AKT1的結合，其次是β-sitosterol與ALB的結合，Luteolin與SRC的結合。使用Pymol軟件對結果進行三維圖形繪制，其中黃色虛線為氫鍵，白色虛線為疏水鍵，綠色虛線為π堆積。見圖7～8。

3 討論

內皮功能障礙、血管收縮增加、動脈重塑等血管變化與高血壓密切相關[11]，而這些血管變化又受到腎素-血管緊張素-醛固酮系統（Renin Angiotensin Aldosterone System，RAAS），交感神經系統，免疫激活和氧化應激等系統的調節，所以通過調節這些病理生理機制，可以起到降壓作用?，F代藥理研究證實，杜仲的提取物木酚素通過抑制cAMP活性、調節NO和RAAS等途徑發揮抗高血壓的作用[12]。天麻提取物3，4-二羥基苯甲醛，可提高主動脈和內皮細胞中NO的產生和一氧化氮合酶（NOS）的活性，從而起到調節血管的作用[13]。川芎提取物可通過抑制鈣離子流，阻斷鉀離子通道，從而使得血管舒張[14]。強力定眩片結合諸味藥物優勢，發揮協同治療高血壓的功效。

藥物-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖顯示，強力定眩片主要是通過作用于槲皮素、山柰酚、刺槐素、丁香亭、木犀草素、去氫雙丁香酚、β-谷甾醇、川芎萘呋內酯、楊梅酮等成分，發揮治療高血壓的作用。排名前20的核心成分，杜仲占10味，野菊花占5味，川芎占4味、天麻占3味，杜仲葉占2味，推測杜仲為君藥，發揮對證之效，其余4味藥物為臣藥，起到協同輔助之功。槲皮素是具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，廣泛分布于植物界中，在氧化應激條件下能減少內皮功能障礙、炎性損傷，且能抗血小板凝集[15]。薈萃研究表明，服用槲皮素對降低血壓具有統計學意義，服用較高劑量的槲皮素（>500 mg）對血壓影響明顯[16]。另外動物實驗發現，槲皮素可以通過減少氧化應激和調節HSP70/ERK/PPARγ信號通路來減輕氟化鈉引起的高血壓[17]。山柰酚屬于黃酮類化合物，存在于各種水果、蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、保護心血管等作用[18-19]，可通過NO-cGMP-PKG途徑誘導內皮依賴性血管舒張，起到降壓作用[20]。刺槐素是心血管領域具有治療潛力的黃酮化合物，可通過抑制ERK通路，下調ARG2增加NO含量，使血管舒張，同時減輕主動脈的纖維化[21]。另外，本研究分子對接結果顯示，核心成分與疾病靶點蛋白存在穩定結合點，結合活性較好，初步驗證強力定眩片可能通過這些成分作用于高血壓疾病靶點。

PPI網絡分析中，我們篩選出了AKT1、ALB、VEGFA、TNF、EGFR、SRC等核心蛋白，這些蛋白均與心血管疾病密切相關。AKT1蛋白調控細胞增殖和生長，是心肌細胞生長的調節開關，可促進生理性心肌肥大，同時對抗病理性肥大[22]，基礎研究發現AKT1/PKB上調可導致血管平滑肌細胞肥大和多倍體化[23]。VEGFA是一種血管生成因子，可通過促進NO介導的血管舒張作用來影響血壓，臨床研究發現，血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）可通過上調VEGF的表達，來降低血壓[24]。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發揮重要的作用，目前抑制EGFR活性正成為治療高血壓的潛在策略[25]，研究發現通過抑制EGFR的表達可減輕5/6腎切除大鼠的高血壓進展程度[26]。此外，我們通過MCODE插件，構建了4個蛋白質BP功能聚類模塊，其中模塊一、模塊二主要涉及血管的調節和高血壓相關信號通路，模塊三涉及脂質代謝過程，模塊四涉及腎上腺素參與調節全身動脈血壓等過程，結果提示強力定眩片可能通過這4個功能模塊起到降壓的作用。

根據生物過程基因富集分析，我們發現靶點基因主要富集于循環系統調控過程、血液循環過程、血管管徑調節、MAPK級聯正向調節、血壓調節等生物過程。ERK是細胞外調節蛋白激酶，是MAPK信號通路成員之一，研究發現ERK1/2信號轉導可維持靜態內皮細胞的完整性[27]，靜態內皮細胞中ERK1/2的缺失會導致心血管疾病的發生和死亡，激活ERK可增強血管平滑肌收縮，促進平滑肌增生[28]。根據KEGG通路分析，我們發現靶點基因主要富集于PI3K-AKT信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、HIF-1等信號通路。PI3K-AKT通路在細胞生長、重塑和凋亡中起關鍵作用，并參與調節血管收縮[29]，通過調節PI3K/AKT通路蛋白的表達，可以起到降低血壓的作用[30]。細胞內鈣信號轉導對心血管活動起到至關重要的作用，血管平滑肌中鈣離子通道調節肌原性張力和血管收縮性，通過阻止鈣離子進入細胞，可使血管松弛，阻力減小，血壓降低[31]。Rap1是一種普遍表達的GTP酶，對內皮細胞的NOS、NO釋放具有調節作用，Rap1基因缺失會使主動脈段血管擴張嚴重減弱[32]。HIF-1為缺氧誘導因子，介導大多數細胞對缺氧的反應，對動脈粥樣硬化及血管重塑起到一定作用，HIF-1可調節初級巨噬細胞中NO的產生，以達到擴張血管的目的;此外研究發現皮膚中的HIF-1有助于調節全身血壓[33-34]。

綜上所述，本研究通過生物信息學的方法初步探討了強力定眩片治療高血壓的作用機制，涉及44個活性成分，305個靶基因，115個信號通路。推測強力定眩片可能通過槲皮素、山柰酚、刺槐素、丁香亭、木犀草素、去氫雙丁香酚、β-谷甾醇等活性成分作用于AKT1、ALB、VEGFA、TNF、EGFR、SRC等靶點，進而調控腎素-血管緊張素-醛固酮系統、血管平滑肌收縮、氧化應激、鈣離子通道等途徑，從而起到降低血壓的功效。不可否認，本研究仍存在許多缺陷，如使用的中藥數據庫不全，靶點預測數據庫不完善，篩選策略不完美，未考慮中藥煎煮后活性成分的改變等[35]。因此，日后還需更多的體內外研究對其作用機制進一步驗證。

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（2020-12-15收稿 責任編輯：楊燕）