Hhip和Lpar2基因表達與胃癌相關性的研究進展

董 賽,李國熊,方家恒,陳 鑫,孫倚天

董賽,李國熊,方家恒,陳鑫,孫倚天,杭州師范大學附屬醫院消化內科 浙江省杭州市 310015

0 引言

胃癌(Gastric cancer,GC)是嚴重危害人類健康的最常見的惡性腫瘤之一.根據國際癌癥研究機構的統計數據,2012年全球GC發病率位于惡性腫瘤發病率第5位、死亡率位于第3位[1].GC的發生經過一系列胃粘膜病理變化,胃上皮內瘤變(gastric intraepithelial neoplasia,GIN)是指基底膜以上上皮的一種非浸潤性腫瘤學改變,包括低級別胃上皮內瘤變(low-grade gastric intraepithelial neoplasia,LGIN)和高級別上皮內瘤變(high-grade gastric intraepithelial neoplasia,HGIN).根據專家共識意見,推薦在早期胃癌和HGIN狀態下及時通過ESD或EMR進行干預,能顯著減少GC的發生率以及改善GC預后.已知與GC相關的基因數目眾多,隨著研究深入,越來越多的基因被發現,針對基因或基因表達產物的靶向治療藥物也逐漸產生,如人表皮生長因子受體2 (HER-2)拮抗劑曲妥珠單抗、酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼.未來GC基因研究前景可觀,不僅可以發掘與GC相關的新基因,也可以研究基因與GC及GIN預后之間的相關性,預測GC及GIN的發生發展并且作為潛在靶點為GC的治療提供更多選擇.

1 Hhip基因與胃癌

人刺猬相互作用蛋白(human hedgehog-interacting protein,Hhip)基因位于染色體3q31.21-31.3,與人類多種腫瘤的發生相關.Hhip基因的過表達抑制非小細胞肺癌與肝癌細胞的增殖、遷移與侵襲,Hhip基因的表達水平或可作為確定非小細胞肺癌分型及TNM分期的參考標準[2,3];早有研究[4]表明Hhip基因沉默與結直腸癌淋巴結轉移、彌漫型胃癌TNM分期有關,體外實驗中,下調Hhip基因的表達水平可顯著增強結腸癌細胞的生長和侵襲能力.近年來,越來越多的研究發現Hhip作為Hh信號通路的負性調控基因,通過抑制Hh信號通路的激活,保持通路的穩定,從而抑制GC的發生發展.

1.1 Hhip基因與Hh信號通路的相關性及其分子機制 多項研究顯示,Hh信號通路的激活與人類多種腫瘤的形成有關,如胃癌、非小細胞肺癌、結腸癌等[5-7].Hh信號通路涉及的成分包括三種Hh配體:SHH (Sonic hedgehog)、IHH (Indian hedgehog)、DHH (Desert hedgehog)及跨膜受體PTCH1 (Patched1)、G-蛋白偶聯受體SMO(Smoothed)、負性調節分子SUFU (Suppressor-of-fused)和轉錄因子GLI (Glioblastoma-associated-protein)家族等.在非配體狀態下,PTCH1受體被主動抑制,阻止激活劑SMO進入初級纖毛,GLI蛋白被磷酸化后部分降解,產生GLI阻遏物形式(GLIR),關閉Hh靶基因的表達.當配體存在時,PTCH1的抑制作用被解除,使Hh信號通路激活,激活過程如圖1所示[8].三種Hh配體通過結合跨膜受體PTCH1激活相同的信號級聯,但這些配體的分布呈現組織特異性,SHH和IHH主要在胃腸道內表達,而DHH的表達僅限于睪丸和神經系統[8].SHH在人類多種消化系統腫瘤中表達上調,如胃癌、結直腸癌,導致Hh信號通路異常激活[9,10].SHH與跨膜受體PTCH1結合后通過七次跨膜蛋白SMO傳導信號至細胞內,使轉錄因子GLI從KIF7和SUFU中解離,轉錄激活因子(GLIs)進入細胞核,誘導多種靶基因的表達.靶基因包括Ptch1、Ptch2及Gli1,其表達增加是激活信號通路的一個高度可靠的指標,Ptch1和Gli1表達產物分別通過負反饋和正反饋回路機制調控Hh信號通路;其他靶基因包括Hhip、Ccnd2、Bcl2、Mycn等以及Wnt信號通路成員,這些靶基因的激活和失活可能參與了正常組織和器官的發育以及腫瘤的發生[8,11].HHIP是一種Ⅰ型膜糖蛋白,由4個主要結構域組成,被認為是三種Hh配體SHH、IHH、DHH的潛在拮抗劑,可以與PTCH1受體競爭性結合三種Hh配體,通過負反饋機制抑制Hh信號通路的激活[12].

圖1 Hh信號通路激活過程.

Hh信號通路涉及多種發育和生理過程,在胚胎發育和組織穩態中起著至關重要的作用.在成人胃中,Hh信號通路不僅調節胃上皮細胞的分化和成熟,而且在胃的生理活動中也是必不可少的.正常胃粘膜上皮細胞分泌SHH,被基質細胞上的受體識別,從而啟動Hh信號級聯,增加下游靶基因的轉錄,這就是所謂的“旁分泌”調控.在GIN中,這種“旁分泌”調節的平衡被打破,SHH表達增加,刺激Hh信號通路過度激活,從而導致化生轉化和纖維組織的生長,進而發生癌變.在GC胃粘膜組織中,除了“旁分泌”調節外,“自分泌”調節也有助于癌癥的進展,GC細胞SHH的表達上調進一步激活Hh信號通路,促進GC的發生發展[8].幽門螺桿菌感染正常胃粘膜后,可直接控制SHH的分泌,間充質干細胞(MSCS)被招募到慢性炎癥部位,重新填充胃上皮細胞,促進胃粘膜正常細胞向異型增生轉變[13].

1.2 Hhip基因表達水平與GIN及GC預后的相關性 Sun等[14]對95例GC、癌旁正常胃粘膜組織及29例GIN患者的胃粘膜組織進行免疫組織化學染色,發現Hhip基因在GC組織中的表達水平顯著降低,在GIN組織中的表達水平低于相鄰正常胃粘膜組織,但高于GC組織樣本;Hhip基因表達水平與淋巴結轉移(P=0.041)、神經系統浸潤(P=0.001)、TNM分期(P=0.007)呈負相關;此外,Hhip基因表達水平較高的GC患者總生存期(overall survival,OS)與無病生存期更長,是GC患者OS的獨立預測因子(P<0.01).另有研究[15]通過PT-PCR法檢測52對GC組織和相應的癌旁正常組織中的Hhip基因表達水平,也得到了類似結果;隨訪3年發現,GC患者中Hhip基因表達水平雖與局部復發無相關性(P=0.58),但與GC轉移呈負相關(P=0.035).上述研究表明,從正常胃粘膜發展到GIN最后成為GC的過程中,Hhip基因的表達水平逐漸下降,相對低表達的GC患者預后較差,其或許能預測GIN的發生發展及GC預后.

1.3 抑制Hhip基因啟動子甲基化是治療GC的潛在新靶點 Song等[15]通過構建病毒Hhip表達載體并轉染AGS細胞株,使GC細胞HHIP蛋白水平升高,對轉染后的GC細胞進行細胞增殖和Transwell實驗,發現GC細胞的增殖和侵襲能力下降;采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSPCR,MSP)法分析GC細胞啟動子甲基化水平,結果顯示被病毒Hhip表達載體轉染后的GC細胞啟動子CpG島甲基化比例為13.85%,顯著低于未被轉染的GC細胞.在一項研究中[16],對30例GC及癌旁正常組織的手術標本采用MSP法進行Hhip基因啟動子甲基化水平檢測,結果表明GC組織Hhip基因啟動子甲基化水平顯著高于癌旁正常組織,啟動子甲基化水平與Hhip基因mRNA的表達水平呈負相關性(P=0.000).藥物5-氮雜胞苷(5-aza-dc)是DNA甲基轉移酶抑制劑,能有效抑制DNA甲基化水平.用不同濃度的5-aza-dc干預GC細胞,均能使GC細胞增殖活力顯著降低,凋亡率升高,其最佳劑量為2.0 μm (P=0.000);5-aza-dc干預后GC細胞的Hhip mRNA及HHIP蛋白水平顯著高于未干預組.因此,抑制Hhip基因啟動子甲基化水平可上調Hhip基因的表達,抑制GC細胞的增殖,誘導GC細胞的凋亡.目前已有研究[8]認為Hh信號通路涉及的某些分子是GC的治療靶點,如抗SHH單克隆抗體5E1通過結合假活性位點阻斷Hh信號通路,環巴胺衍生物IPI-92直接與SMO的蛋白螺旋體結構結合而使其失活,Hhip基因啟動子序列或許也可以成為GC治療的潛在新靶點.

2 溶血磷脂酸受體2基因與GC

溶血磷脂酸受體2 (Lysophosphatidic acid receptor 2,Lpar2)基因位于染色體19p12,其編碼的LPA2是一個G蛋白偶聯受體,由348個氨基酸組成,分子量約為39 kDa,屬于內皮分化基因受體(EDG)家族[17,18].研究表明,LPA2與人類許多腫瘤相關,LPA2與其配體LPA結合可激活LPA信號通路,進而促進細胞增殖和惡性轉化,如乳腺癌中LPA2受體表達水平高提示預后不良[19],肝癌中Lpar2 mRNA的高表達與癌細胞低分化有關[20],結腸癌細胞中 LPA2受體的高表達促進了耐藥性的獲得,促使抗癌藥物失效[21].

2.1 Lpar2基因表達產物與ATX-LPA信號軸及其分子機制 近年來的研究表明,LPA2受體與異三聚體G蛋白Gi/o、Gq/11和G12/13家族結合,這些G蛋白通過Ras、Rac、PI3K、MAPK、PLC、二?；视头肿拥葐酉掠涡盘柾?這些信號通路與腫瘤的存活、轉移等密切相關[22].Yamashita等[23]通過免疫組織化學方法檢測204例GC組織中LPA2受體的表達水平,結果顯示LPA2受體在腸型癌中優先表達(67%),明顯高于彌漫型癌(32%);此外,彌漫型癌中LPA2受體的表達水平提高了癌細胞的淋巴管浸潤率(P=0.0421)、靜脈浸潤率(P=0.0023)以及淋巴結轉移率(P=0.0159),而在腸型癌中未發現兩者有顯著相關性,表明LPA2的表達水平可能與彌漫型癌的腫瘤分期(T1-4)呈正相關.Zhang等[24]的研究結果表明ATX-LPA信號軸通過PI3K/Akt和MAPK/ ERK介導的機制誘導骨橋蛋白(osteopontin,OPN)的表達,OPN是一種細胞因子,在細胞粘附、趨化、凋亡、侵襲和遷移等過程中發揮著重要作用,OPN在ATX-LPA軸誘導的GC細胞遷移中是不可或缺的,它能保護GC細胞躲避紫杉醇誘導的凋亡.

ATX-LPA信號軸的激活與多種腫瘤相關,如甲狀腺癌、乳腺癌[25,26].溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)是一種生物活性磷脂,在細胞膜合成過程中產生,是存在于所有真核生物組織和血漿中的強大的細胞外信號分子.細胞外合成LPA有一個主要途徑,在該途徑中,磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺等前體分子分別通過磷脂酶A1 (PLA1)和磷脂酶A2 (PLA2)作用產生溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰絲氨酸(LPS)和溶血磷脂酰乙醇胺,然后在自身毒素(ATX)作用下轉化為LPA.ATX被認為是ATX-LPA信號軸的守門人,在信號傳導中起著至關重要的作用[18],抑制ATX活性可影響ATXLPA信號軸的激活,從而消除LPA對細胞存活和遷移的大部分影響[27].ATX-LPA信號通過至少6個G蛋白偶聯受體(LPA1-6)來轉導,LPA與受體結合后介導許多生物學活動.在腫瘤細胞中,ATX-LPA信號被放大和控制,以支持自身的生長和轉移,這可能是通過增加ATX或LPA受體的表達來實現的.ATX-LPA信號傳導可被磷酸脂質磷酸酶(LPPs)終止,所以細胞外LPA的動態平衡主要是由ATX與LPPs來調控.LPA-ATX信號不僅可以刺激腫瘤的進展和轉移,還能通過保護癌細胞免受細胞毒性藥物和照射所造成的損傷,在形成抗癌藥物耐藥性中發揮關鍵作用[28].然而,對于Lpar2及ATX-LPA信號軸在GC發生發展中的分子機制還有待進一步研究.

2.2 Lpar2基因表達水平與GIN及GC預后的相關性Zhang等[29]對51例GC、21例GIN組織及13例正常人胃粘膜組織進行免疫組織化學染色后發現,不同分化程度的GC組織LPA2受體陽性率不同,其中低分化為89.5%,中分化為81.3%、高分化為25%;LGIN的陽性率為25%,HGIN的陽性率為33.3%,正常胃粘膜的陽性率23.1%,各組之間均具有統計學差異;通過實時聚合酶璉反應(PCR)法檢測Lpar2 mRNA在GC和GIN組織中的表達水平,結果分別為0.045±0.018和0.021±0.009,差異有顯著性;根據年齡、Lauren分型等不同臨床特征對51例GC患者進行分組,分別比較各組內LPA2受體陽性率,發現其與GC的浸潤深度、Lauren分型、血管浸潤、淋巴結轉移、臨床分期密切相關(P<0.05),且浸潤深度深、臨床分期晚、存在血管浸潤及淋巴結轉移的患者LPA2受體陽性率更高.上述研究顯示,從正常胃粘膜發展到GIN,最后進展為GC的過程中,LPA2受體的表達陽性率逐步提升,低分化的GC患者受體陽性率更高,提示LPA2受體陽性的GIN患者或許更有可能進展為GC,LPA2受體水平較高的GC患者預后不良.

2.3 Lpar2基因是治療GC的潛在新靶點 上皮細胞間質化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細胞向間質細胞轉化的過程,E-cadherin為上皮細胞的分子標志物,Vimentin為間葉細胞的分子標志物,間質化的上皮細胞E-cadherin表達降低,Vimentin表達升高,從而具備游走遷移和浸潤能力,在腫瘤侵襲轉移過程中發揮重要作用.馬琳娜等[30]用Lpar2表達載體轉染 SGC-7901 GC細胞后,發現隨著LPA2的水平增加,E-cadherin的表達逐漸降低,Vimentin的表達逐漸升高,提示 LPA2參與了GC細胞的EMT過程,LPA2水平增加后的GC細胞更加容易轉移;Transwell侵襲和遷移實驗顯示GC細胞的侵襲和遷移能力隨著 LPA2水平增高而增強;通過細胞增殖和凋亡實驗發現,如上調LPA2受體水平,GC細胞的凋亡能力降低,增殖能力增強(P<0.05).上述研究表明,若能尋找到一種有效的藥物抑制Lpar2基因的表達,進而抑制GC細胞的增殖,促進凋亡,或許又是一個GC治療的潛在新靶點.

3 Hh信號通路與ATX-LPA信號通路之間的相關性

目前尚未見研究報道Hhip基因與Lpar2基因之間存在聯系,但兩者參與的信號傳導通路可能存在交聯關系,影響腫瘤的發生發展.有研究發現,Hh信號通路和參與調節增殖、分化、凋亡等多種細胞功能的PI3K/Akt通路相互激活、促進,共同參與GC細胞的EMT過程,加速GC進展和轉移[31];另外,Hh信號通路效應蛋白GLI1也可以直接激活多種細胞功能基因的表達,表達產物包括SNAI1蛋白和OPN[8],其中SNAI1作為EMT多種信號通路的關鍵調控因子,與腫瘤轉移密切相關[32];Po等[33]發現在肺癌中GLI1可以通過MAPK/ERK信號途徑激活,多種機制誘導觸發MAPK/ERK/GLI1級聯反應,包括KRAS突變.另有研究報道ATX-LPA信號通路與PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路也存在交聯關系,誘導OPN的表達,加速GC細胞遷移[24];LPA2受體可以激活MAPK/ERK信號轉導通路的上游因子Ras,調節腫瘤細胞的增殖、分化和存活,在腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用[22];同時LPA2受體也參與GC細胞的EMT過程[30].Hh信號與ATXLPA信號通路之間或許存在更多的交聯關系,對GC細胞的增殖、轉移、分化和耐藥產生影響,有待進一步研究探討.

4 展望

綜上所述,在GC的發生發展過程中,Hhip和Lpar2基因的表達分別發揮著抑制和促進的作用;GIN胃粘膜組織中Hhip基因的表達水平低于正常胃組織但高于GC組織,Lpar2基因的表達水平與之恰為相反;GC患者的預后與Hhip基因表達水平呈正相關,與Lpar2呈負相關.因此,聯合檢測Hhip和Lpar2的表達水平有望預測GIN的發生發展和GC的預后,Hhip與Lpar2也是GC治療潛在的新靶點,為臨床診治提供新思路.但LGIN和HGIN胃黏膜組織的Hhip及Lpar2基因表達水平是否均存在差異,以及是否可以此評估LGIN發展為HGIN的風險程度,早期對高風險的LGIN患者進行內鏡下治療,尚需進一步探索.