核桃葉多糖對脂質和DNA氧化損傷的作用研究

于書燕，楊淑青，解志軻，賀明，于少軒，劉青，肖海芳

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000）

生物體內自由基的生成與清除處于動態平衡狀態，一旦機體受到有害因素的刺激，體內自由基便會過度累積并造成生物大分子氧化損傷，包括蛋白質氧化、脂質過氧化、DNA氧化損傷等，進而導致衰老及多種退行性疾病的發生，如癌癥、糖尿病、動脈粥樣硬化等[1-3]。因此，抗氧化物質對于清除過多的自由基及抑制氧化損傷進而維持人體健康方面發揮著重要作用。

研究發現合成抗氧化劑可以有效治療多種疾病，但一些合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）和二丁基羥基甲苯（butyl hydroxytoluence，BHT）等則會損害人體肝臟功能并誘發癌癥。因此，植物提取物作為良好的抗氧化劑來源已被廣泛應用[4-5]。大量研究表明，攝入天然抗氧化物質可以減少機體的氧化損傷程度，并降低多種疾病的患病風險[6-9]。多糖在自然界中分布廣泛，是人體所需基本物質之一。近年來，植物多糖的抗氧化活性受到了各科學領域的關注。

前期試驗結果表明，核桃葉多糖具有清除自由基的能力且對蛋白質氧化損傷具有顯著的保護作用[10-11]。本研究進一步探討了核桃葉多糖對Cu2+/H2O2、2，2′-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽[2，2′-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]和亞鐵離子（ferrous ion，Fe2+）誘導的脂質、DNA氧化損傷的影響，旨在從生物大分子角度系統闡明核桃葉多糖的抗氧化活性。為進一步揭示核桃葉多糖的抗氧化活性提供了數據支持，同時為核桃葉多糖應用于食品、化妝品和藥品行業提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃葉多糖：山東理工大學考林微生物脂質實驗室自制；健康SD大鼠：山東大學實驗動物中心。

AAPH、2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituricacid，TBA）：上海麥克林生化科技有限公司；大豆卵磷脂、亞油酸（linoleic acid，LA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）：國藥集團化學試劑有限公司；pBR322DNA：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS28恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV-2600紫外分光光度計：日本島津公司；LE303E千分之一天平：美國METTLER-TOLEDO公司；AD500SH勻漿機：上海昂尼儀器儀表有限公司；5810R高速離心機：德國Eppendorf公司；GelDoc XRS凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；DYCP-32C核酸電泳槽：北京六一生物科技有限公司；Milli-Q生化分析型超純水機：美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鼠組織勻漿的制備

在試驗過程中對SD大鼠的處理符合動物管理方法的相關章程。取出處死后SD大鼠體內的腦組織和肝臟組織，用預冷過的生理鹽水將血漬洗凈，吸去殘留水分后取1.0 g腦或肝臟組織并剪碎，然后加入9 mL預冷過的生理鹽水，在冰水浴中勻漿10 min。在4℃，4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液，即得10%的組織勻漿[12]。

1.3.2 核桃葉多糖對脂質氧化損傷的保護作用

1.3.2.1 核桃葉多糖對烷氧自由基誘導脂質氧化損傷的影響

取一定體積的組織勻漿（肝臟組織或腦組織）和終濃度為10、20、30、40 mg/mL核桃葉多糖溶液置于多支2 mL離心管中，混勻，37℃水浴30 min。然后加入終濃度為50 mmol/L在37℃預熱過的AAPH溶液，空白組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替AAPH，誘導組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替核桃葉多糖溶液?；靹蚝蠓旁?7℃水浴中繼續處理4 h測定肝勻漿和腦勻漿中脂質氧化損傷程度。

1.3.2.2 核桃葉多糖對羥基自由基誘導脂質氧化損傷的影響

組織勻漿與核桃葉多糖的處理方式同1.3.2.1中所述。向試驗組加入終濃度為25 mmol/L和0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，空白組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替H2O2和CuSO4，誘導組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替核桃葉多糖溶液?；旌暇鶆蚝?7℃繼續水浴90 min，測定肝勻漿和腦勻漿中脂質氧化損傷程度。

1.3.2.3 核桃葉多糖對Fe2+誘導卵磷脂氧化損傷的影響

參照黃曉昆等[13]的方法并略加修改。將卵磷脂溶于0.05 mol/L pH7.4磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中制備脂質體，分別加入不同質量濃度的核桃葉多糖（樣品溶液終濃度分別為10、20、30、40、50 mg/mL），混勻后于37℃孵育10 min，然后加入終濃度為0.8 mmol/L的FeSO4溶液，37℃繼續水浴40 min后檢測卵磷脂氧化損傷程度。

1.3.2.4 核桃葉多糖對Fe2+誘導亞油酸氧化損傷的影響

以Fe2+/VC為誘導體系誘導LA氧化損傷。在LA中加入不同濃度的核桃葉多糖（樣品溶液終濃度分別為 10、20、30、40、50 mg/mL），混勻后加入終濃度為50 μmol/L和 1 mmol/L的 FeSO4和 VC溶液，37℃避光水浴24 h后檢測亞油酸氧化損傷程度。

1.3.2.5 脂質過氧化程度測定

采用TBA反應法檢測脂質體氧化損傷的程度[14]。取上述處理后的脂質反應體系200 μL，分別加入20%TCA 800 μL 和 0.8%TBA 800 μL，混勻，置于沸水浴中加熱30 min。冷卻后離心10 min（6 000 r/min），取上清液在532 nm波長條件下測定吸光度。脂質過氧化程度計算公式如下。

式中：A為試驗組的吸光度；A0為誘導組的吸光度。

1.3.3 核桃葉多糖對DNA氧化損傷的保護作用

1.3.3.1 核桃葉多糖對烷氧自由基誘導DNA氧化損傷的影響

試驗以pBR322DNA為模型考察核桃葉多糖對自由基誘導的氧化損傷的抑制效果。將1 μL pBR322DNA加入微量離心管中，試驗組中加入不同濃度的核桃葉多糖，混勻，37℃水浴30 min。然后試驗組加37℃水浴2 min后的AAPH，對照組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）代替AAPH?；靹蚝蠓旁?7℃水浴中繼續處理，4 h后測定DNA氧化損傷程度。

1.3.3.2 核桃葉多糖對羥基自由基誘導DNA氧化損傷的影響

核桃葉多糖與pBR322DNA的孵育處理方式同1.3.3.1中所述。向試驗組加入終濃度為25 mmol/L和0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，對照組以相同體積的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）代替H2O2和CuSO4?；旌暇鶆蚝?7℃繼續水浴90 min，測定DNA氧化損傷程度。

1.3.3.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳

利用瓊脂糖凝膠電泳考察pBR322DNA氧化損傷程度[15]。取0.2 g瓊脂糖溶于20 mL TAE緩沖液，放在微波爐中加熱處理1 min，冷卻后加入2 μL溴化乙錠，混勻，倒膠，待其凝固后拔掉梳子。處理后的DNA反應體系中加入上樣緩沖液，混勻后每孔加入等量的反應液，調整電泳電壓為120 V，時間為30 min。凝膠電泳結束后在GelDoc XRS凝膠成像系統下成像，并采用Image J軟件分析所成圖像的條帶灰度。

1.4 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2016處理實驗數據并進行One-Way ANOVA分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 核桃葉多糖對脂質氧化損傷的保護作用

2.1.1 核桃葉多糖對SD大鼠腦勻漿中脂質（rat brain lipid，RBL）氧化損傷的保護作用

肝臟是機體重要的代謝器官，極易受到自由基的攻擊產生脂質過氧化，所以肝勻漿常被作為脂質模型來考察植物活性物質的抗氧化能力[16-17]。圖1、圖2分別為核桃葉多糖對烷氧自由基與羥自由基誘導的RBL氧化損傷的抑制效果。

圖1 核桃葉多糖對烷氧自由基誘導RBL氧化損傷的保護作用Fig.1 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on alcoxyl radical-induced lipid oxidative damage in RBL

圖2 核桃葉多糖對羥自由基誘導RBL氧化損傷的保護作用Fig.2 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on hydroxyl radical-induced lipid oxidative damage in RBL

從圖1、圖2中可以看出，與空白對照組相比，Cu2＋/H2O2與AAPH誘導組脂質過氧化水平明顯升高；經10 mg/mL～40 mg/mL核桃葉多糖處理之后，相對于誘導組，RBL氧化損傷程度極顯著降低（P＜0.01），且呈濃度依賴關系。上述結果說明，核桃葉多糖抑制了烷氧自由基與羥基自由基誘導RBL氧化損傷。

2.1.2 核桃葉多糖對SD大鼠肝勻漿中脂質（rat liver lipid，RLL）氧化損傷的保護作用

核桃葉多糖對AAPH與Cu2＋/H2O2誘導體系中RLL過氧化水平的影響見圖3、圖4。

圖3 核桃葉多糖對烷氧自由基誘導RLL氧化損傷的保護作用Fig.3 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on alcoxyl radical-induced lipid oxidative damage in RLL

圖4 核桃葉多糖對羥自由基誘導RLL氧化損傷的保護作用Fig.4 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on hydroxyl radical-induced lipid oxidative damage in RLL

從圖3、圖4中可以看出，與空白組相比，Cu2＋/H2O2與AAPH誘導組脂質過氧化水平明顯升高；經10mg/mL～40 mg/mL的核桃葉多糖預先孵育處理后，羥自由基與烷氧自由基誘導的脂質過氧化水平明顯下降，且多糖濃度越高保護效果越好（P＜0.01）。上述結果說明，核桃葉多糖對烷氧自由基與羥基自由基引發的RLL氧化損傷具有明顯的保護作用。

2.1.3 核桃葉多糖對Fe2＋誘導卵磷脂氧化損傷的保護作用

卵磷脂中的多不飽和脂肪酸在金屬離子催化下發生脂質過氧化，導致組織損傷[18]。核桃葉多糖對羥基自由基誘導的大豆卵磷脂氧化損傷的抑制如圖5所示。

圖5 核桃葉多糖對Fe2+誘導卵磷脂脂質過氧化的保護作用Fig.5 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on Fe2+-induced lecithin liposomes peroxidation

由圖5可知，與Fe2＋誘導組相比，空白組脂質體過氧化水平較低。核桃葉多糖在10 mg/mL～50 mg/mL的濃度范圍內均對脂質過氧化表現出較強的濃度依賴性的抑制作用（P＜0.01）。當濃度達到50 mg/mL時，由Fe2＋引起的卵磷脂過氧化程度降低到30.85%。由此可知，核桃葉多糖可明顯阻止因羥基自由基引發的卵磷脂過氧化程度。

2.1.4 核桃葉多糖對Fe2＋誘導亞油酸氧化損傷的保護作用

機體產生的氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化[19]。核桃葉多糖對Fe2＋誘導的亞油酸脂氧化損傷的抑制如圖6所示。

圖6 核桃葉多糖對Fe2+誘導亞油酸脂質過氧化的保護作用Fig.6 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on Fe2+-induced linoleic acid liposomes peroxidation

由圖6可知，10 mg/mL的核桃葉多糖對羥基自由基誘導的亞油酸氧化損傷無明顯抑制效果，而經20mg/mL～50 mg/mL的核桃葉多糖處理后，氧化降解程度明顯降低（P＜0.01）。上述結果說明，核桃葉多糖在一定濃度范圍內抑制了Fe2＋誘導的亞油酸過氧化水平。

2.2 核桃葉多糖對DNA氧化損傷的保護作用

過多的自由基也會導致包括DNA鏈斷裂、DNA堿基修飾、DNA位點突變、DNA雙鏈畸變等形式的DNA氧化損傷[20]。圖7為核桃葉多糖對烷氧自由基誘導pBR322DNA氧化損傷的影響。

圖7 核桃葉多糖對烷氧自由基誘導DNA氧化損傷的保護作用Fig.7 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on alcoxyl radical-induced DNA oxidative damage

從圖7中可以看出，空白組pBR322DNA的存在形式為超螺旋結構，AAPH誘導組DNA幾乎全部轉變成了開環結構，說明烷氧自由基誘使pBR322DNA發生了氧化損傷，破壞了其超螺旋結構。0.3mg/mL～0.5mg/mL的核桃葉多糖均可抑制這種轉變，且隨著濃度增加，超螺旋結構的pBR322DNA明顯增多。上述結果表明，核桃葉多糖對烷氧自由基誘導的DNA氧化損傷具有顯著的保護作用。

核桃葉多糖對羥基自由基誘導pBR322DNA氧化損傷的影響如圖8所示。

由圖8可知，羥基自由基可明顯破壞pBR322DNA的超螺旋結構（P＜0.01）。經0.10 mg/mL～0.20 mg/mL的核桃葉多糖孵育處理之后，超螺旋結構的pBR322DNA比例顯著增加（P＜0.01），開環結構減少。由此可知，核桃葉多糖能夠保護pBR322DNA不被羥基自由基氧化降解。

圖8 核桃葉多糖對羥自由基誘導DNA氧化損傷的保護作用Fig.8 Protective effect of walnut leaf polysaccharide on hydroxyl radical-induced DNA oxidative damage

3 結論

本研究利用Cu2＋/H2O2和AAPH兩種不同的自由基誘導體系，探討核桃葉多糖對大鼠肝勻漿和腦勻漿、卵磷脂、亞油酸及DNA氧化損傷的影響。結果表明，核桃葉多糖在一定濃度范圍內對羥基自由基以及烷氧自由基誘導的脂質和DNA氧化損傷具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性。該研究從生物大分子角度評價了核桃葉多糖的抗氧化活性，并為農業廢棄核桃葉的綜合利用提供了思路。