響應面優化酶法提取馬鈴薯膳食纖維工藝

高曉麗*，楊東

呂梁學院生命科學系（呂梁 033001）

我國是世界上馬鈴薯總產量最多的國家，種植區域分布廣泛[1]。馬鈴薯含有非常豐富的膳食纖維，而膳食纖維被稱為“第七大營養素”，合理攝入能降低膽固醇、血糖、血脂，減少肥胖和心血管疾病以及某些胃腸道疾病的發生[2-3]。我國大部分馬鈴薯都是簡單的粗加工，這使其綜合經濟效益受到很大的影響，因此高效提取馬鈴薯中的膳食纖維可以有效提高資源的利用率，具有一定的社會效益。

馬鈴薯膳食纖維中纖維素和半纖維素含量較高，木質素含量相對較低，具有更好的柔性，是制備高品質膳食纖維的良好原料[4]。目前馬鈴薯中膳食纖維的提取方法主要有化學法、酶法、酶堿法和發酵法等[5]。在這些方法中，酶法提取條件溫和，專一性強，產品純度高，品質較好而且節約能源，對環境污染較小，是常用的提取膳食纖維的方法之一[6]。

目前國內關于用酶法提取膳食纖維的研究多集中于對酶添加量、溫度、pH和料液比等因素方面，且多采用單因素試驗和正交試驗進行提取工藝的優化，而對于酶的添加量、酶的作用時間以及不同酶之間這些因素的交互影響的研究尚少。用α-淀粉酶和木瓜蛋白酶從馬鈴薯中提取膳食纖維，對不同酶的添加量和作用時間的各自影響以及彼此之間的交互影響進行研究，并采用響應面法進行工藝的優化，確定酶法提取馬鈴薯膳食纖維的最佳工藝條件，以期為馬鈴薯膳食纖維提取工藝的進一步優化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯，市售；無水乙醇（分析純），天津市光復科技發展有限公司；丙酮（分析純），洛陽市化學試劑廠；鹽酸、氫氧化鈉（分析純），天津市光復科技發展有限公司；α-淀粉酶、木瓜蛋白酶，蘇仟泊生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

VIS-723N紫外可見分光光度計，上海佑科分析儀器儀表有限公司；ZN-08粉碎機，北京興時利和科技發展有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；DZF-6021真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；XK78-1磁力攪拌器，姜堰市新康醫療器械有限公司；SHB-Ⅲ真空抽濾機，鄭州長城科工貿有限公司；SC-04低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；PHS-2S型pH計，上海越平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

新鮮馬鈴薯洗凈、切塊，用打漿機打碎，用紗布包裹并用水沖洗，干燥后用粉碎機粉碎，過0.250 mm孔徑篩，密封備用。

1.3.2 膳食纖維提取[7-9]

稱取1 g樣品（M1），加入25 mL蒸餾水和一定量α-淀粉酶，調pH至6.5，加蓋鋁箔，于60 ℃水浴一定時間，然后100 ℃下保持8 min滅酶。冷卻后再加入木瓜蛋白酶，調節pH至6.5，充分混勻，于60 ℃水浴加熱一定時間，然后轉移至100 ℃加熱保持8 min滅酶，冷卻后離心，在4 000 r/min的轉速下離心15 min。離心后取上清液進行濃縮，加入4倍體積分數為95%的乙醇，預熱到50 ℃，靜置1.5 h后離心，在4 000 r/min的轉速下離心20 min，然后置于60 ℃條件下烘干，稱其質量（M2）。將離心后的沉淀用體積分數為78%乙醇、體積分數為95%乙醇及丙酮洗滌殘渣，洗滌后抽濾去除洗滌液，將殘渣烘干（105 ℃）至恒重，稱其質量（M3）。

1.3.3 單因素試驗

以α-淀粉酶添加量、α-淀粉酶作用時間、木瓜蛋白酶添加量和木瓜蛋白酶作用時間為影響因素，提取時只改變一個因素，保持其余三個因素水平不變，以馬鈴薯膳食纖維提取率為評價依據，進行單因素試驗。具體方案見表1。

表1 單因素試驗水平選取表

1.3.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的結果上，選取合適水平，運用四因素三水平的Box-Behnken響應面設計方法，以α-淀粉酶添加量（A）、α-淀粉酶作用時間（B）、木瓜蛋白酶添加量（C）和木瓜蛋白酶作用時間（D）為自變量，以馬鈴薯膳食纖維提取率Y為響應值進行優化試驗。

1.3.5 膳食纖維提取率計算

式中：Y為提取率，%；M1為試驗樣品的質量，g；M2為試驗樣品中可溶性膳食纖維的質量，g；M3為試驗樣品中不可溶性膳食纖維的質量，g。

1.3.6 性能測定

溶脹性、持水力與持油力測定方法參考張華等[10]的方法。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1α-淀粉酶添加量對馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶作用時間120 min、木瓜蛋白酶添加量150 U/g、木瓜蛋白酶酶解時間90 min的條件下，研究α-淀粉酶添加量對膳食纖維提取率的影響，結果如圖1所示。在α-淀粉酶添加量處于較低水平時，隨著α-淀粉酶的添加量不斷增加，膳食纖維的提取率不斷上升，在α-淀粉酶添加量為300 U/g時達到最高。當α-淀粉酶添加量繼續增加到420 U/g時，膳食纖維提取率存在小幅度下降，直至趨于穩定的現象。導致這種結果的原因可能是在酶添加量較低時，添加的酶量不足以完全水解原料中的淀粉物質，即淀粉分解不充分，導致膳食纖維分離不完全，因此在酶添加量較低時膳食纖維的提取率也較低。而在酶添加量較高時，高濃度的酶會導致半纖維素等生理活性物質發生降解[4]，使得提取率又出現下降。因此，依據單因素試驗的結果，響應面試驗設計選擇240，300和360 U/g這3個水平。

圖1 α-淀粉酶添加量對膳食纖維提取率的影響

2.1.2α-淀粉酶作用時間對馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶添加量300 U/g、木瓜蛋白酶添加量150 U/g、木瓜蛋白酶作用時間90 min的條件下，研究α-淀粉酶作用時間對膳食纖維提取率的影響，試驗結果如圖2所示。在α-淀粉酶作用時間處于較短的時間水平時，膳食纖維的提取率隨著α-淀粉酶作用時間的增加而迅速增高，并在90 min時達到最高點。當α-淀粉酶作用時間繼續增加時，膳食纖維的提取率緩慢下降，慢慢趨于穩定。導致這種結果的原因可能是作用時間較短，反應液中淀粉底物充足，分解的一直是淀粉物質，膳食纖維不斷被分離出來，因此膳食纖維的提取率一直上升。隨著作用時間的不斷延長，當淀粉底物分解完后，膳食纖維提取率達到最大，繼續增加反應時間導致膳食纖維部分分解，使得提取率出現下降。因此，根據單因素試驗的結果，響應面試驗設計選取60，90和120 min這3個水平。

圖2 α-淀粉酶作用時間對膳食纖維提取率的影響

2.1.3 木瓜蛋白酶添加量對馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶添加量300 U/g、α-淀粉酶作用時間120 min、木瓜蛋白酶作用時間90 min的條件下，研究木瓜蛋白酶添加量對膳食纖維提取率的影響，試驗結果如圖3所示。在木瓜蛋白酶添加量處于較低水平時，膳食纖維提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而增加，并在200 U/g時達到最高點。當木瓜蛋白酶添加量繼續增加至250 U/g時，膳食纖維提取率出現輕微降低的現象。導致這種結果的原因可能是酶添加量不足時，添加的酶不足以完全水解原料中的蛋白質，膳食纖維分離不完全，隨著酶添加量的增加，蛋白質被完全水解，提取率達到最高點。當酶添加量再增加時，由于蛋白水解并不增加，但纖維可能有損失，導致膳食纖維提取率出現輕微下降。因此，依據單因素試驗的結果，響應面試驗設計選取150，200和250 U/g這3個水平。

圖3 木瓜蛋白酶添加量對膳食纖維提取率的影響

2.1.4 木瓜蛋白酶作用時間對馬鈴薯膳食纖維提取率的影響

在α-淀粉酶添加量300 U/g、α-淀粉酶作用時間120 min、木瓜蛋白酶添加量150 U/g的條件下，研究木瓜蛋白酶作用時間對膳食纖維提取率的影響，試驗結果如圖4所示。在木瓜蛋白酶作用時間處于30~90 min的較低水平時，馬鈴薯膳食纖維提取率隨作用時間的增加而增加，在90 min時達到最高點。隨著木瓜蛋白酶作用時間繼續增加至150 min，膳食纖維提取率隨木瓜蛋白酶作用時間的增加而降低。導致這種結果的原因可能是作用時間較短時，原料中的蛋白質充足，酶一直在分解蛋白質，膳食纖維不斷被分離出來，使得膳食纖維的提取率不斷增加，當底物中的蛋白質都分解完后，膳食纖維的提取率達到最大。繼續增加反應時間會導致部分膳食纖維分解，使得提取率出現下降。因此，根據單因素試驗的結果，響應面試驗設計選取60，90和120 min這3個水平。

圖4 木瓜蛋白酶作用時間對膳食纖維提取率的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計方案與結果

通過單因素試驗，找出研究因素的最佳提取參數范圍，運用四因素三水平的響應面試驗設計共進行29組試驗對酶法提取膳食纖維進行工藝優化，對試驗數據進行處理分析，以獲得其最佳的工藝參數。因素編碼水平見表2，試驗方案設計及結果見表3。

表2 響應面因素編碼水平設計表

運用Design-Expert軟件，按照表3中的響應面試驗數據通過多項擬合，獲得研究因素與膳食纖維提取率的多元二次回歸方程：

表3 響應面試驗設計及結果

對回歸方程進行方差分析，其分析結果見表4及表5 。由表4可知，該模型的p值小于0.01，表明該模型具有高度的顯著性，也表明模型的擬合程度好、精度高，適合用來描述研究因素與提取率之間的關系，同時，也表明可以用此模型來進行膳食纖維提取率的預測。在模型中，α-淀粉酶添加量、α-淀粉酶作用時間和木瓜蛋白酶作用時間對膳食纖維提取率的影響非常顯著（p＜0.01）。木瓜蛋白酶添加量對膳食纖維提取率的影響顯著（p＜0.05），表明研究因素對于膳食纖維提取率的影響都較大。在因素的交互作用方面，A和C，B和D，C和D的交互作用非常顯著，A和D的交互作用顯著，A和B，B和C的交互作用不顯著。模型的二次項對膳食纖維提取率的曲面影響均非常顯著。模型的失擬項在α=0.05水平上不顯著（p=0.334 4＞0.05），表明模型比較符合實際情況，可以用此模型來預測馬鈴薯膳食纖維在研究因素處于各水平時的提取率。因素的主效應關系為α-淀粉酶作用時間＞木瓜蛋白酶作用時間＞α-淀粉酶添加量＞木瓜蛋白酶添加量。

表4 膳食纖維提取率回歸方程方差分析表1

由表5可知，模型的相關系數R2=0.981 2，校正系數Radj2=0.962 4，表明只有3.76%的膳食纖維提取率不能由此模型預測得出。模型的變異系數C.V.=1.60%，表明模型與試驗的實際情況擬合較好，能很好地反映真實的試驗值，因此該模型的可靠性高。

表5 膳食纖維提取率回歸方程方差分析表2

2.2.2 交互作用影響分析

由圖5~圖10可知，因素A和C，B和D，C和D的等高線呈橢圓形，說明A和C，B和D，C和D之間的交互作用顯著。因素A和B，B和C的等高線呈圓形，說明A和B，B和C之間的交互作用不顯著。從響應面曲面圖上可以看出，膳食纖維的提取率存在最大值。

圖5 因素A和B交互影響的等高線和響應面

圖6 因素A和C交互影響的等高線和響應面

圖10 因素C和D交互影響的等高線和響應面

圖7 因素A和D交互影響的等高線和響應面

圖8 因素B和C交互影響的等高線和響應面

圖9 因素B和D交互影響的等高線和響應面

通過軟件對回歸模型的分析，得出最佳的提取工藝參數：α-淀粉酶添加量308.56 U/g，α-淀粉酶作用時間97.09 min，木瓜蛋白酶添加量202.94 U/g，木瓜蛋白酶作用時間83.25 min。預測的膳食纖維提取率為40.286%。

2.2.3 驗證試驗

為了驗證模型的可靠性，以模型預測結果的工藝條件進行試驗驗證。為方便試驗，驗證試驗各因素選取α-淀粉酶添加量308 U/g，α-淀粉酶作用時間97 min，木瓜蛋白酶添加量203 U/g，木瓜蛋白酶作用時間83 min。經過3次平行試驗，在該條件下，馬鈴薯膳食纖維提取率為39.61%，與預測值之間差異小于3%。因此該模型對馬鈴薯膳食纖維提取的預測比較準確，具有使用價值。

2.3 理化性質測定結果

由表6可知，試驗提取出的膳食纖維其溶脹性達到7.29 mL/g，持水力達到6.73 g/g，持油力達到3.51 g/g。魏春光[11]采用酶法提取出的馬鈴薯膳食纖維，其溶脹性為7.37 mL/g，持水力為7.00 g/g，持油力為1.90 g/g。通過對比，表明試驗提取出的膳食纖維的理化性質較好。

表6 膳食纖維理化指標測定結果

3 結論

以馬鈴薯為原料，從中提取膳食纖維，并采用響應面法優化，得到最佳的提取工藝條件：α-淀粉酶添加量308 U/g，α-淀粉酶作用時間97 min，木瓜蛋白酶添加量203 U/g，木瓜蛋白酶作用時間83 min。在此條件下，馬鈴薯膳食纖維提取率為39.61%，與理論得率差異較??；且提取出的膳食纖維，其溶脹性達到7.29 mL/g，持水力達到6.73 g/g，持油力達到3.51 g/g，理化品質也較好。此工藝可對進一步完善酶法提取馬鈴薯膳食纖維的工藝提供參考。