魚源膠原肽特征質量指標檢測分析

牛林林，袁丹丹，陳 磊，蔡久慶，劉 娟，張 明，陳 勉，張曉元，張艷艷，劉 飛＊

（1. 山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發酵與精制國家地方聯合工程實驗室 博士后科研工作站，山東 濟南 250101；2. 東阿生力源阿膠股份有限公司 聊城市阿膠多肽提取技術研發重點實驗室，山東 聊城 252218）

膠原肽，又稱膠原水解物，是由膠原蛋白衍生的短鏈氨基酸，由膠原蛋白經過熱處理、酸堿酶酶解，發生分子鏈解體、斷裂，再經加工所得產物[1]。膠原肽主要來源于骨骼、牛皮、豬皮、魚類和家禽等[2-4]，作為小分子蛋白肽，具有生物可利用性，易分解，并能很好地被吸收到血液中，可在全身傳播、修復和提供能量[5-8]。

Koji等[6]研究表明，口服膠原肽1～2 h后，可在人體血液中檢測到羥脯氨酸濃度升至峰值，以肽的形式存在，主要是三肽Gly-Pro-Hyp。Kim等[9]研究表明，小分子膠原肽可從血管轉移到表皮系統，從而刺激皮膚成纖維細胞合成膠原蛋白、彈性纖維和透明質酸，改善皮膚的光滑度，增加皮膚的柔韌性和彈性。研究表明[10-11]細胞可將轉移至組織中的多肽構建成完整的膠原螺旋，修復皮膚、骨骼和關節，對骨質疏松有一定預防和治療作用。由于膠原肽富含多種氨基酸，具有營養和生理調節雙重作用，廣泛用于膳食食品、保健食品、美容食品、運動營養食品等領域[12-13]。

隨著膠原肽市場規模增大，不同來源的膠原肽檢測標準有所差異，表1為不同檢測標準（依據國家標準/行業標準）中膠原肽的理化指標。相對分子質量、羥脯氨酸的含量是區別一般食品的關鍵質量參數，國標GB 31645-2018中膠原蛋白肽比魚源膠原肽的指標范圍寬泛，魚源膠原肽的國家標準和行業標準中規定的膠原肽相對分子質量（Mr）和羥脯氨酸含量差異也較大。

表1 不同檢測標準中膠原肽理化指標

由于標準指標的差異，市售魚源膠原肽的產品質量信息基本相似，大多未標明低分子量氨基酸（Mr小于1000 ）占比，以及包含特征氨基酸羥脯氨酸在內的氨基酸組成差異，售價差異較大，消費者難以合理選擇。因此本文選取了4種不同品牌，具有代表性的魚源膠原肽產品與本實驗室研制的膠原肽進行特征質量指標檢測分析，旨在篩選出低分子量占比較高，特征性氨基酸羥脯氨酸較高的魚源膠原肽，為魚源膠原肽產品選擇和功效研究提供實驗依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；超純水（實驗室自制）；無水乙醇、鹽酸、苯酚（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；三氟乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、十水合四硼酸鈉、硼酸（分析純，國藥集團）；18種氨基酸標準溶液、OPA衍生試劑（島津公司AJS-01 氨基酸柱前衍生化方法包）；細胞色素C（95 %，Mr：12 355）；抑肽酶（6000 U/mg，Mr：6511）；桿菌酶（Mr：1450）；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（97 %，Mr：451）；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（97 %，Mr：189）。

產品1～4購于市場中不同品牌的膠原肽，X肽由本實驗室研制，均為魚源膠原肽。

2 方法

2.1 微波消解處理

將產品1～4和X肽每件樣品準確稱取約0.1 g，各置于微波消解罐中，已有樣品的各消解罐中分別加入5 ml 鹽酸（1 %苯酚）和5 ml 純凈水，進行微波消解，1600 W，150 ℃，15 min。微波消解程序完成并冷卻后，分別將消解液定容至100 ml，各取出1 ml液體分別置于蒸發皿中60 ℃蒸發干燥后，各加入1 ml的稀鹽酸將溶質溶出，置試管中待測。

2.2 GPC方法測定膠原肽相對分子質量

2.2.1 標準溶液的配制 精密稱取相對分子質量標準的細胞色素C、抑肽酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸適量，分別用流動相配制成濃度為1.0 g的不同相對分子質量的肽標準品溶液，用孔徑為0.2 μm濾膜過濾后分別進樣，得到系列標準品的色譜圖。以相對分子質量的對數（lg Mr）對保留時間作圖或作線性回歸得到Mr校正曲線及其方程。

2.2.2 樣品的配制 稱取樣品125.0 mg，用流動相溶解并定容至25 ml，超聲振蕩10 min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2 μm，0.5 μm聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾，其濾液用于測定。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：TSKgel G2000SWxL凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm），流動相：乙腈-水-三氟乙酸（40:60:0.05）；檢測波長：220 nm；流速：0.5 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μl；等梯度洗脫。

2.3 OPA柱前衍生法測定膠原肽氨基酸含量

2.3.1 氨基酸標準混合溶液 含18種氨基酸，Asp（門冬氨酸）、Glu（谷氨酸）、Ser（絲氨酸）、His（組氨酸）、Gly（甘氨酸）、Thr（蘇氨酸）、Arg（精氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Val（纈氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Ile（異亮氨酸）、Phe（苯丙氨酸）、Lys（賴氨酸）、Leu（亮氨酸）、Hyp（羥脯氨酸）、Pro（脯氨酸）濃度均為2.5 μmol/ml，Cys（半胱氨酸）為1.25 μmol/ml。

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2.3.2 衍生用混合氨基酸標準溶液的配制 量取氨基酸標準溶液100 μl，置入2 ml樣品瓶，加入內標溶液50 μl，0.l mol/L鹽酸溶液400 μl，混勻，作為衍生用混合氨基酸標準溶液。

2.3.3 衍生用游離氨基酸樣品溶液的配制 準確稱取樣品適量，加0.l mol/L鹽酸溶液制成氨基酸總濃度約為100 mg/ml溶液作為檢測游離氨基酸樣品溶液（溶液pH應不小于1.0），準確量取樣品溶液500 μl，置入2 ml樣品瓶，準確加入內標溶液50 μl，混勻，作為衍生用游離氨基酸樣品溶液。

2.3.4 衍生用微波消解后樣品溶液的配制 準確稱取樣品適量，加0.l mol/L鹽酸溶液制成氨基酸總濃度約為1 mg/ml溶液作為檢測微波消解后總氨基酸樣品溶液（溶液pH應不小于1.0），準確量取樣品溶液500 μl，置入2 ml樣品瓶，準確加入內標溶液50 μl，混勻，作為衍生用微波消解后樣品溶液。

2.3.5 色譜條件 色譜柱：AJS-02 氨基酸分析專用柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A：0.45 %Na2HPO3·12H2O-0.475 %Na2B4O7·10H2O，pH 8.2；流動相B：甲醇-乙腈-水（450:450:100，v/v/v）；檢測波長：UV 檢測器：338 nm（一級氨基酸），262 nm（二級氨基酸）；流速：1.6 ml/min；柱溫：50 ℃；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

3 結果與分析

3.1 膠原肽相對分子質量結果與分析

3.1.1 不同樣品分子質量的分布情況 分別測定產品1～4和X肽，結果見圖1，色譜圖均較好地顯示了5種不同來源膠原肽樣品中不同分子質量的分布情況。

圖1 不同樣品的Mr色譜圖

采用SHIMADZU GPC數據處理軟件分別對以上色譜圖進行處理。洗脫物質的分子質量隨保留時間增加而減小。由圖1可見，產品1～4的出峰時間相對一致，則分子質量大小差別不大，X肽出峰時間較晚，峰型相對單一，則X肽分子質量較小。產品1～4及X肽中一些主要色譜峰的保留時間、重均相對分子質量（Mw）、數均相對分子質量（Mn）、多分散系數d（Mw/Mn）的基本情況見表3。

由表3可見，產品1～4的Mw主要集中在1000～2000之間，X肽的Mw相對較小，主要集中在1000以下，占比約為88.47 %，比產品1～4Mw小于1000的低分子量組分占比高約92.75 %～115.62 %。

表3 不同產品相對分子質量及其分布測定結果

3.1.2 不同樣品相對分子質量占比 對產品1～4和X肽進行了相對分子質量占比統計，結果見圖2。

圖2 不同膠原肽產品Mr占比

由圖2可見，產品1～4中相對分子質量的占比大小基本相同，X肽中低分子量占比遠高于市售樣品的魚源膠原肽。

3.2 膠原肽氨基酸結果與分析

3.2.1 氨基酸對照品 對20種氨基酸對照品進行高效液相分析，結果見圖3。

圖3 混合氨基酸對照品HPLC圖

3.2.2 不同樣品中游離氨基酸含量 將產品1～4和 X肽進行氨基酸分析，結果見圖4。

由圖4可見，各產品中游離氨基酸含量較少。產品1中精氨酸含量最高為67.37 μg/ml，其他17種氨基酸的含量均不超過50 μg/ml；產品2中丙氨酸的含量最高為112.18 μg/ml，其他均不超過50 μg/ml；產品3和產品4中氨基酸含量均不超過50 μg/ml；X肽中亮氨酸含量最高為65.79 μg/ml，其它均未超過40 μg/ml，其中羥脯氨酸的含量為0。上述結果表明，產品1～4和X肽中游離氨基酸濃度為0.2 %～0.5 %，表明樣品主要以低聚肽的形式存在。

圖4 市售樣品和X肽中游離氨基酸含量

3.2.3 水解后不同樣品游離氨基酸含量 對產品1～4和X肽按照“2.1”項方法微波消解后進行氨基酸分析，結果見圖5。

圖5 水解后不同樣品中氨基酸含量

由圖5可見，將市售樣品和X肽水解后，各種氨基酸的含量均明顯增加，多數氨基酸含量高于100 μg/ml，產品1～4和X肽氨基酸含量變化趨勢較相似。產品2、產品3、產品4和X肽中谷氨酸含量約為300 μg/ml，產品1谷氨酸含量為229.67 μg/ml；各樣品中甘氨酸含量約為500 μg/ml，精氨酸含量約為150 μg/ml，丙氨酸含量約為200 μg/ml。其中特征氨基酸羥脯氨酸和脯氨酸含量差別較大，X肽的羥脯氨酸（228.71 μg/ml）和脯氨酸（286.98 μg/ml）含量明顯高于市售樣品。

3.2.4 不同樣品中肽氨基酸組成含量 各樣品水解之后氨基酸含量減去未水解之前的氨基酸含量，得樣品的肽氨基酸組成含量，結果見圖6。

圖6 不同樣品中肽氨基酸組成含量

由圖6可見，本次實驗共檢測18種氨基酸，X肽中有17種氨基酸含量高于產品1，13種氨基酸含量高于產品2，14種氨基酸含量高于產品3，13種氨基酸含量高于產品4；尤其特征性氨基酸羥脯氨酸和脯氨酸的含量（分別為228.71，166.41 μg/ml）遠高于市售4種產品（羥脯氨酸分別為145.58，75.81，52.66，122.49 μg/ml，脯氨酸分別為208.3，170.57，166.41，196.16 μg/ml）。

3.2.5 羥脯氨酸在不同膠原肽產品中的比例 根據HPLC檢測出的羥脯氨酸和脯氨酸的含量，計算羥脯氨酸和脯氨酸在膠原肽中的占比，結果見圖7。

圖7 羥脯氨酸和脯氨酸占比

由圖7可見，X肽中羥脯氨酸含量較高，比產品1～4高約50.91% ～332.11 %；脯氨酸含量比產品1～4中含量高約33.91 %～71.41 %。

4 結論和討論

不同魚源膠原肽產品的低分子量組分占比、特征性氨基酸和其他氨基酸含量存在明顯差別。本文以實驗室研制的X肽與4種市售魚源膠原肽微波消解后進行分子量大小和氨基酸含量比較。結果表明，X肽具有低分子量組分、羥脯氨酸、脯氨酸含量高的特點，更易被人體吸收和發揮功效。以上述關鍵質量指標為指針，通過優化不同來源底物、酶解工藝和篩選高活性肽段，達到降低產品用量提高產品功效的效果，將是以后研究的重點。同時，本文為膠原肽質量控制方法提供實驗依據。