甘肅產罌粟不同部位中5種生物堿的含量測定

張曉萍，張虹艷，石曉峰, ，張彩霞，李志俊，王 蕙

（1. 蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅 蘭州 730050；2. 甘肅省醫學科學研究院，甘肅 蘭州 730050）

罌粟（Papaver somniferum L.）是一年生栽培草本植物，嚴禁非法種植，在我國某些特許單位栽培以供藥用[1]。其藥用部位主要為種子、罌粟殼及罌粟殼中割取的生鴉片和經再加工的生鴉片[2]。其中罌粟殼作為傳統中藥飲片，既是麻醉藥品，又是毒性藥品，還具有成癮性，是國家麻醉藥品目錄中唯一中藥飲片。罌粟所含生物堿種類達100多種，已經分離出的生物堿有20余種，其中嗎啡（morphine）、可待因（codeine）、蒂巴因（thebaine）、那可?。╪arcotine）和罌粟堿（papaverine）是重要的植物源生物堿，為醫藥工業上鎮痛藥、鎮咳藥和解痙藥的重要成分[3-4]。自2008年12 月衛生部《關于開展全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治的緊急通知》將罌粟殼列入首批非食用物質名單，有關食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因5種成分的含量測定方法報道較多[4-10]，亦有野罌粟（Papaver nudicule L.）植株不同部位嗎啡含量測試的報道[11]，但尚未見罌粟不同部位中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁5種生物堿的的研究報道，為此本試驗針對甘肅農墾種植罌粟，采用HPLC法建立了同時測定嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因5種生物堿的含量測定方法，對罌粟不同部位（根、莖、葉、殼）中5種生物堿的含量進行分析，以期為其合理開發利用和科學監管提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，配置DAD檢測器，LabSolution 工作站（日本Shimadzu公司），MS105DU十萬分之一電子天平（Mettler Toledo公司），ME102/24萬分之一電子天平（Mettler Toledo公司），IQ7000超純水機（德國默克公司），CQ-500B 型數控超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）。

1.2 試藥

嗎啡對照品（批號：171201-201324，純度：99.1%）、磷酸可待因對照品（批號：171203-201306，純度：97.5 %）、蒂巴因對照品（批號：171216-201304）、鹽酸罌粟堿對照品（批號：171214-201205，純度：99.9 %）、那可丁對照品（批號：171224-201304，純度：99.9 %）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、庚烷磺酸鈉、磷酸為色譜純，水為超純水。

樣品為科研用特殊藥品，采集、購買經過甘肅省藥品監督管理局批準。罌粟不同部位（根、莖、葉、殼）于2020年6月采集于甘肅農墾集團有限責任公司所轄5個不同農場（用FA～FE表示），原植物經蘭州市食品藥品檢驗研究院張彩霞副主任藥師鑒定為罌粟科植物罌粟 Papaver somnifer L.。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取嗎啡對照品10.21 mg，磷酸可待因對照品10.43 mg，蒂巴因對照品15.35 mg，鹽酸罌粟堿對照品11.82 mg，那可丁對照品11.58 mg分別置入10 ml量瓶，加甲醇-5 %醋酸溶液（20:80）溶解并定容，即得5種生物堿各自單一對照品貯備液。分別精密吸取各單一對照品貯備液適量，加5 %醋酸的20 %甲醇溶液配置成每1 ml含嗎啡40.47 μg，磷酸可待因20.34 μg，蒂巴因7.675 μg，鹽酸罌粟堿11.81 μg，那可丁23.14 μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取罌粟殼粉末（50～60目）約0.5 g，罌粟根、莖、葉粉末（24～50目）約1.0 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入甲醇-5 %醋酸溶液（20:80）溶液25 ml，超聲提取30 min，放冷至室溫，過濾，藥渣加溶劑25 ml再同法提取1次，過濾，合并濾液，蒸干，用甲醇-5 %醋酸溶液（20:80）溶液復溶并定容于25 ml量瓶，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-庚烷磺酸鈉溶液（B）（稱取庚烷磺酸鈉1.01 g，加水適量使溶解，混勻，用水稀釋至1000 ml，用磷酸調節pH值至2.6），梯度洗脫（0～2 min，15 % A；2～35 min，15 %～40 %A；35～80 min，40 % A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：238 nm（罌粟堿），216 nm（其余4個生物堿）；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μl。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，依“2.2”項下色譜條件測定。結果樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因的色譜峰和保留時間與對各對照品相一致，將保留時間一致的色譜峰進行UV光譜比對，峰純度均大于0.99，分離度均大于1.5，理論板數以嗎啡計不小于10 000，方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）和樣品（B）的HPLC圖

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察 分別精密吸取嗎啡對照品貯備液50，100，200，250，500 μl，磷酸可待因對照品貯備液50，100，200，250，500 μl，蒂巴因對照品貯備液5，10，25，50，100 μl，鹽酸罌粟堿對照品貯備液10，20，50，100，200 μl，那可丁對照品貯備液10，20，50，100，250 μl置于5 ml量瓶，用甲醇-5 %醋酸溶液（20:80）溶液稀釋至刻度，配制成系列濃度的混合對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣10 μl，測定峰面積。以對照品濃度（X，μg/ml）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得到嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因的回歸方程、相關系數和線性范圍見表2。結果表明，5種生物堿在各自濃度范圍內與其峰面積積分值呈良好線性關系。

表2 線性關系

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μl，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，測得5種生物堿嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因的峰面積和相對保留時間的RSD分別為0.09 %，0.10 %，0.14 %，0.11 %，1.8 %和0.12 %，0.24 %，0.83 %，0.74 %，0.35 %，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μl，依“2.2”項下色譜條件，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定峰面積，測得5種生物堿嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的峰面積的RSD分別為0.10 %，0.15 %，1.58 %，0.98 %，0.87 %，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取FA農場的罌粟殼粉末（50～60目） 6份，按“2.1.2”項下方法操作制備供試品溶液，依“2.2”項下色譜條件，每次進樣10 μl測定含量。測得嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的平均含量分別為3.5825 ，0.874 75，0.099 465，0. 553 75，0. 5595 mg/g，RSD分別為0.68 %，0.92 %，1.25 %，0.98 %，1.02 %（n=6），表明試驗方法重復性良好。

2.4.5 檢測限與定量限 取“2.2.1”項下制備好的混合對照品適量，用甲醇-5 %醋酸溶液（20:80）溶液逐級稀釋后進樣分析，測定嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的檢測限（S/N=3）分別為0.0012，0.0013，0.0014，0.0012，0.0014 μg和定量限（S/N=10）分別為0.0040，0.0043，0.0058，0.0042，0.0052 μg。

2.4.6 回收率試驗 取已知含量（嗎啡3.582 mg/g，可待因0.8747 mg/g，罌粟堿0.5537 mg/g，那可丁0.5595 mg/g，蒂巴因0.09946 mg/g）的FA農場罌粟殼粉末（50～60目）6份，每份約0.4 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，再分別精密加入對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法操作制備供試品溶液，依“2.2”項下色譜條件，每次進樣10 μl測定含量，計算回收率，結果嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因的平均加樣回收率為91.04 %～99.44 %，RSD為1.07 %～1.59 %（n=6），表明該方法準確度良好，結果見表3。

表3 回收率試驗結果（n=6）

2.5 樣品含量測定

取罌粟殼粉末（50～60目）3份，每份約0.5 g，根、莖、葉粉末（24～50目）各3份，每份約1.0 g，按“2.1.2”項下方法操作制備供試品溶液，按擬定的含量測定方法測定樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因的含量。結果表明，罌粟殼中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁的含量為2.617～3.582 ，0.4859～0.8747，0.0665～0.0994，0.3221～0.5537，0.4095～0.5806 mg/g；罌粟根、莖、葉中嗎啡含量為0.924～1.351，0.314～0.458，0.984～1.421 mg/g，可待因含量為0.5414～0. 8305，0.2147～0.3214，0.4765～0.6247 mg/g，蒂巴因、罌粟堿、那可丁未檢出。結果見表4。

表4 罌粟不同部位中5種生物堿的含量測定結果/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

文獻報道的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁含量測定的檢測波長為250 nm[12]，216 nm[13]。本文在相同色譜條件下，將對照品溶液、同一供試品溶液用DAD檢測器檢測，結果嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁的最大吸收為216 nm，罌粟堿的最大吸收為238 nm；故選擇238 nm作為罌粟堿的檢測波長，216 nm作為其余4個生物堿的檢測波長。

3.2 色譜條件的選擇

曾采用C18柱分別考察了甲醇-0.01 mol/L的磷酸二氫鉀[11,14]、甲醇-0.1 %磷酸[15]、甲醇-0.5 %乙酸銨和乙腈-0.5 %乙酸銨[16]的色譜分離效果，也采用HILIC柱考察了含有0.1 %甲酸和10 mmol/L甲酸胺的水溶液-乙腈[17-19]，均未取得良好的分離效果。最后采用甲醇-水流動相系統[20-21]，添加離子對試劑并用磷酸調節pH改善峰形，發現嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁峰形對稱、基線平穩均獲得良好分離，相鄰色譜峰分離度均大于1.5。通過考察不同柱溫（20，25，30 ℃）對5種生物堿色譜分離的影響，發現柱溫為30 ℃時蒂巴因未獲得有效分離，25 ℃時未達到基線分離，最后設定柱溫20 ℃。使用不同型號的C18色譜柱重復實驗，結果均能重現。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

罌粟生物堿多為異喹啉生物堿，根據其理化性質，參考文獻方法[20-22]采用不同比例的甲醇、醋酸、水的混合提取溶劑以及單用甲醇為提取溶劑，分別加入25 ml超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，發現以甲醇為提取溶劑罌粟堿的提取率較高，以甲醇-5 %醋酸溶液（20:80）溶液為提取溶劑嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁的提取率較高，究其原因可能是罌粟堿溶于有機試劑、不溶于水，部分成鹽后溶于水。通過對溶劑的加入量、提取次數的考察，綜合考慮選擇甲醇-5 %醋酸溶液（20:80）溶液為提取溶劑，溶劑加入量為25 ml，提取次數為2次。

3.4 含量測定結果分析

甘肅產區不同農場罌粟植株不同部位中5種生物堿的含量差異不大，可能是所采集的罌粟種植區域土壤、海拔、氣候等條件接近。罌粟殼中5種生物堿的含量高低依次為嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因，蒂巴因平均含量僅為0.0812 mg/g。由樣品含量結果可見，除了罌粟殼的藥用價值外，罌粟的根、莖、葉可作為鎮痛藥、鎮咳藥和解痙藥的提取原料，同時也要防范它們的非法添加。

綜上，以甘肅境內不同產地罌粟為研究對象，建立HPLC測定嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁5種生物堿的含量測定方法，簡便可行、靈敏準確，可為罌粟殼的質量評價提供參考。通過分析植株不同部位（根、莖、葉、殼）中5種生物堿的含量，為其合理開發利用和科學監管提供依據。