不同醋制方法對決明子指標成分的影響

李筱玲，何長安，高珂欣，鄧寒霜，張 飛

（1. 商洛學院，陜西 商洛 726000；2. 陜西天士力植物藥業有限責任公司，陜西 商洛 726000）

決明子為豆科植物鈍葉決明Cassia obtusifolia L.或決明（小決明）Cassia tora L.的干燥成熟種子[1]。其性微寒，味苦、甘、咸，入肝、腎、大腸經；是我國傳統中醫常用中草藥，具有潤腸通便，清肝明目的功效[2]。決明子為藥食兩用藥，有效成分主要為蒽醌類化合物[3]。其中所含游離蒽醌及結合蒽醌均具有降血脂、降血壓、抗氧化、保肝等作用，臨床應用廣泛[4-5]。其內在質量評價多以橙黃決明素、大黃酚為指標，2020年版《中國藥典》規定決明子含大黃酚（C15H10O4）不得少于0.20 %，含橙黃決明素（C17H14O7）不得少于0.080 %，其含量測定方法多用HPLC法[6-8]。長期或大劑量服用決明子會引發一定的肝腎毒性，其毒性與結合蒽醌的含量相關，結合蒽醌含量越低，毒性越低[9]。目前決明子的臨床應用飲片主要有兩種，即生決明子和炒決明子。古人用“以苦酒漬經三日暴干”的炮制方法炮制決明子，現代研究結果也表明醋制決明子后，游離蒽醌的含量顯著提高，是生品的4倍，是清炒品的近2倍[10]。因為決明子中很多蒽醌類成分是以結合蒽醌形式存在，醋制的過程引入了醋酸，而結合蒽醌對醋酸敏感，使其水解轉變為游離蒽醌；加之炮制過程受熱影響，濕熱條件下，結合蒽醌也可能被酶解，游離蒽醌含量增加。因此，對決明子醋制工藝進行研究非常有必要，可確保決明子的用藥安全性。同時醋制引藥入肝，可提高決明子清肝明目的作用，增強其功效。本文以橙黃決明素、大黃酚2種成分的含量為評價指標，采用單因素結合正交試驗法，對影響醋制決明子品質的加醋量、悶潤時間、烘制溫度、烘制時間等4個因素水平進行了考察，以期為決明子飲片的炮制工藝研究提供一定的幫助。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent HP1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ5200DB 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ML204萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；750T型多功能粉碎機（鉑歐五金廠）；UV-2082 紫外-可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1.2 試藥

決明子，購自陜西省商洛市香菊大藥房（寧縣康盛園藥業有限在責任公司生產，批號：Y18110803）；9度純釀米醋（佛山市海天調味食品股份有限責任公司）；乙腈[色譜純，利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司]；三氯甲烷、乙醇等（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；大黃酚對照品（批號：171118）、橙黃決明素對照品（批號：171218），由北京世紀奧科生物技術有限公司提供，純度均大于99 %。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 取大黃酚對照品、橙黃決明素對照品適量，精密稱定，加無水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液制備混合對照品，得2種對照品實際濃度分別為35.2，23.3 μg/ml 。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 ml蒸干，加稀鹽酸30 ml，置水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30 ml，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯（2:1）混合溶液使溶解，轉移至25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。2.1.3 色譜條件 Hypersil Gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈作為流動相A，0.1 %磷酸溶液作為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為284 nm，柱溫30 ℃，流速1 ml/min；理論塔板數按橙黃決明素峰計不低于3000。在此色譜條件下，樣品中各色譜峰分離度均可達到1.5以上。

表1 流動相梯度洗脫表

2.1.4 樣品測定 取各試驗處理所得決明子樣品適量，照“2.1.2”項中方法制備供試品溶液，以0.45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取濾液10 μl進樣，照“2.1.3”項進行HPLC分析，記錄色譜圖，計算橙黃決明素和大黃酚的含量。

2.2 系統適應性試驗

2.2.1 專屬性試驗 照“2.1.1”項方法分別制備橙黃決明素、大黃酚單一對照品和陰性對照溶液；照“2.1.3”項進行HPLC分析，記錄色譜圖。結果表明，各樣品中橙黃決明素、大黃酚的保留時間與對照品一致，2個對照品色譜峰的理論塔板數均在9000以上，單對照品及陰性對照色譜圖均顯示，無其他雜質組分干擾含量測定結果。各組分色譜圖見圖1 。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.2.2 線性關系考察 分別精密吸取2，4，8，10，16，20 μl對照品溶液注入液相色譜儀，照“2.1.3”項進行分析。以濃度（μg/ml）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程。得橙黃決明素的線性回歸方程是Y=45 717X+239.42，R2=0.9998；大黃酚的線性回歸方程是Y=19 041X+9371.8，R2=0.9998。橙黃決明素在濃度為4.66～46.6 μg/ml之間具有良好線性關系，大黃酚在濃度為7.04～70.4 μg/ml之間具有良好線性關系。

2.2.3 精密度試驗 精密吸取大黃酚、橙黃決明素混合對照品溶液10 μl，照“2.1.3”項進行HPLC分析，連續進樣5次。以大黃酚、橙黃決明素色譜峰面積計算RSD，分別為1.27 %，1.16 %，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.4 重復性試驗 取同一決明子樣品，照“2.1.2”項方法，平行處理5份供試品溶液，照“2.1.3”項進行HPLC分析。以大黃酚、橙黃決明素色譜峰面積計算RSD，分別為1.57 %，2.34 %，表明所用供試品制備方法具有良好的重復性。

2.2.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液，照“2.1.3”項進行HPLC分析，每間隔0，2，4，6，8，12 h進樣，以大黃酚、橙黃決明素色譜峰面積計算RSD，分別為1.28 %，0.95 %，表明供試品溶液在12 h內具有良好的穩定性。

2.2.6 加樣回收試驗 取已知含量的醋制決明子樣品9份，每份0.5 g，精密稱定重量，平均分成3組，按低、中、高濃度分別加入混合對照溶液，每組3個重復，按“2.1.2”項制備供試品溶液，照“2.1.3”項進行HPLC分析，計算加樣回收率，結果表明橙黃決明素、大黃酚平均回收率分別為99.2 %，99.6 %，RSD分別為1.78 %，1.34 %，說明所用檢測方法具有良好的準確性。

2.3 單因素試驗

以加醋量、悶潤時間、烘制時間、烘制溫度4個因素為考察對象，每因素設5個不同水平，以橙黃決明素、大黃酚含量進行綜合評分。綜合評分標準為，橙黃決明素含量權重60分，大黃酚含量權重40分。計算公式如下：

綜合評分=橙黃決明素含量×60+大黃酚含量×40

2.3.1 加醋量的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別加入樣品量10 %，20 %，30 %，40 %，50 %的米醋，其他條件固定為，悶潤時間1 h、烘制溫度60 ℃、烘制時間3 h，每組2個重復，考察加醋量對醋制決明子質量的影響，結果表明加醋量為30 %為最佳。

2.3.2 悶潤時間的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別悶潤1，2，3，4，5 h，其他條件固定為，加醋量30 %、烘制溫度60 ℃、烘制時間3 h，每組2個重復，考察悶潤時間對醋制決明子質量的影響，結果表明悶潤3 h為最佳。

2.3.3 烘制溫度的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別在40，50，60，70，80 ℃下烘制，其他條件固定為，加醋量30 %、悶潤時間3 h、烘制時間3 h，每組2個重復，考察烘制溫度對醋制決明子質量的影響，結果表明在80℃下烘制為最佳。

2.3.4 烘制時間的影響 取10份同批決明子樣品，等分為5組，分別烘制1，2，3，4，5 h，其他條件固定為，加醋量30 %、悶潤時間3 h、烘制溫度80℃，每組2個重復，考察烘制時間對醋制決明子質量的影響，結果表明烘制4 h為最佳。

2.4 正交試驗設計與結果

取單因素試驗所得優水平為中間水平，分別對加醋量（A）、悶潤時間（B）、烘制溫度（C）、烘制時間（D）進行4因素3水平正交試驗，評價辦法與單因素試驗相同。正交試驗因素水平設置見表2，每個試驗條件平行處理2份樣品，試驗結果見表3，方差分析見表4。

表2 決明子醋制工藝正交試驗因素水平設置

表3 決明子醋制工藝正交試驗結果

表4 正交試驗方差分析結果

由表3、表4可見，各因素對醋制決明子品質影響大小順序為A（加醋量）>C（烘制溫度）>D（烘制時間）>B（悶潤時間），其中加醋量與烘制溫度對試驗結果有顯著性影響。由結果可見，醋制決明子的最佳炮制工藝條件為A2B3C2D3。即加醋量30 %、悶潤4 h、烘制溫度80 ℃、烘制5 h。

2.5 驗證試驗

因優選出的最佳處理條件并未出現在正交試驗中，為確保研究結果的準確性，本文對最優工藝進行了驗證。具體方法如下，稱取同批決明子藥材3份，每份50 g，分別加入15 ml米醋，拌勻，悶潤4 h后，在80 ℃下烘制5 h。照前述方法檢測得橙黃決明素、大黃酚含量平均值分別為0.183 %、0.341 %，平均綜合評分為24.62（RSD為1.9 %），高于全部9個正交試驗處理，表明所優選出的最優工藝條件真實可信、重復性好，可為決明子飲片炮制生產實際提供參考。

3 結論與討論

決明子有效成分主要為蒽醌類物質。其中，結合蒽醌是瀉下主要成分，有一定毒性；游離蒽醌為抗菌主要成分，并有降血脂、降血壓、抗氧化等作用。橙黃決明素、大黃酚均為游離蒽醌，是決明子降脂主要成分，因此以橙黃決明素、大黃酚的含量為決明子飲片質量評價指標，具有一定的合理性，有一定的實際指導意義。

決明子有醋制、炒制（清炒、鹽炒）和酒制等炮制規格，不同的炮制方法、炮制工藝條件對決明子中有效成分的含量有很大的影響。目前有關決明子炮制方法的研究主要集中在清炒品方面，對決明子其他傳統炮制方法的報道甚少，特別是關于醋制決明子的工藝研究未見有報道。

本課題組在前期研究中，采用醋炙、醋蒸、醋煮、醋烘、醋悶等不同方法對決明子進行了炮制，發現醋烘法所得飲片中總蒽醌的含量為0.680 %（以1,8-二羥基蒽醌為對照品，用0.6 %醋酸鎂甲醇溶液顯色，采用紫外-可見分光光度法在520 nm檢測），是5種方法中僅次于醋蒸法（0.687 %）的，接近于生品（0.742 %）；同時發現，醋烘法所得飲片的橙黃決明素含量最高為0.15 %，大黃酚為0.27 %，也高于生品（0.13 %，0.26 %）?？紤]到醋烘法相較于醋蒸法，可簡化操作環節，提高工作效率，有利于大規模生產，故本文對以烘法炮制醋決明子的最佳工藝進行了研究，最終確定醋制決明子的最優炮制藝條件為：加醋量30 %，悶潤時間4 h，烘干溫度80℃，烘干時間為5 h。經驗證試驗，在此最優條件下炮制所得醋制決明子中橙黃決明素和大黃酚含量平均值分別為0.183 %，0.341 %，較之前工藝所得飲片含量有明顯增加，表明本研究成果具有一定的應用價值。