3種山茶屬植物花粉活力測定及貯藏條件

廖美蘭，孫利娜，蒙 芳，杜 鈴，林 茂，黃麗蕓

（廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西南寧 530002）

花粉是開展雜交育種最基本的材料，雜交過程中經常會遇到花期不遇和親本相距較遠等問題，需要貯藏花粉，貯藏后的花粉活力是雜交成功的關鍵，授粉前需對花粉活力進行檢測［1-3］。目前，花粉活力測定主要有離體培養法和染色法。離體培養法可觀察到花粉粒的萌發情況，測定出的花粉活力接近自然的花粉活力，可應用于大多數植物的花粉活力測定［4］，但最佳培養條件的篩選較復雜，培養基的配方、pH 值、萌發時間及溫度等都會影響萌發［5］。染色法是常用的快速檢測花粉活力的方法［6］，常見的有醋酸洋紅染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法、碘-碘化鉀（I2-KI）染色法和FDA 熒光染色法［7-12］，操作較簡便。

崇左金花茶（Camellia chuongtsoensis）是金花茶組植物中較獨特的一種金花茶；花期長，四季開花不斷，開花后2～3 個月果實即可成熟；葉片小，枝葉茂密，植株緊湊，既可用于園林美化，也可盆栽觀賞；還可作為黃色茶花育種材料。毛籽金花茶（C.ptilosperma）5月始花，7 — 8月盛花，9月— 翌年4月均有少量花朵開放；杜鵑紅山茶（C.azalea）的葉形和花朵與杜鵑（Rhododendron simsii）類似，花色艷紅，密生枝頂，四季有花；這兩種植物均與崇左金花茶花期相近，均為夏季開花的山茶屬原生種。

目前，對金花茶花粉檢測的研究報道較少[13-14]。本研究采用醋酸洋紅染色法、TTC 染色法和離體萌發法，研究崇左金花茶、毛籽金花茶和杜鵑紅山茶的花粉活力，以期篩選出簡便、快速而準確的花粉活力測定方法和貯藏方法，服務于崇左金花茶、毛籽金花茶和杜鵑紅山茶的雜交育種工作，同時也為山茶屬植物的雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試崇左金花茶為10～15年生實生苗，平均株高1.2～1.5 m；杜鵑紅山茶為3～5年生嫁接苗,平均株高1.5 m；毛籽金花茶為10～15年生實生苗，平均株高1.2～1.5 m。以上3 種植物均采用控根器地栽于廣西壯族自治區林業科學研究院花卉所苗圃（108°21'E，22°56'N），生長良好。

1.2 試劑

醋酸洋紅染色液、2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑、無水乙醇和蒸餾水。

1.3 儀器設備

電子天平（精度為0.000 1 g）、Nikon ECLIPSE E200 顯微鏡（10 × 0.25 鏡檢）、智能光照培養箱、單凹載玻片、蓋玻片、鑷子和膠頭吸管。

1.4 試驗方法

1.4.1 花粉收集

2020年10 — 12月，上午8:00～9:00 摘取3 種植物的初放花朵帶回實驗室，用尖頭鑷子夾取花藥平鋪于硫酸紙上。用毛筆刷取新鮮花粉，立即開展試驗；將硫酸紙上的花粉粒放入25 ℃培養室陰干，當日下午待花粉自然散出后，用毛筆收集于棕色離心管中，貼上標簽備用。

1.4.2 花粉貯藏

將離心管中的花粉分別置于室內自然溫度下、4 ℃低溫干燥冰箱內（花粉放入硅膠密封袋中）和-18 ℃冷凍干燥冰箱內（花粉放入硅膠密封袋中）保存。第3、6、10、20、30、60、90、120、150 和180 天，采用醋酸洋紅染色法測定花粉活力。

1.4.3 花粉活力測定

采用醋酸洋紅染色法[6]、TTC 染色法[15]和離體萌發法[16]測定3 種山茶屬植物新鮮花粉活力，采用醋酸洋紅染色法測定3 種山茶屬植物貯藏花粉活力。每種花粉均制作3 張玻片，每片取3 個視野，分別計算染色率（萌發率），取平均值。

配制3 種花粉萌發培養基，1 號（10%蔗糖+0.02%H3BO3+ 0.5% 瓊脂）、2 號（12% 蔗糖+0.06%H3BO3+ 0.5% 瓊脂）和3 號（15% 蔗糖+0.12%H3BO3+0.5%瓊脂）。將3種山茶屬植物新鮮花粉分別置于3 種培養基上培養，培養溫度分別為25、27 和30 ℃，培養時間為3h，計算花粉萌發率，確定最佳培養基和最佳培養溫度?；ǚ酃荛L度等于或超過花粉粒直徑視為花粉已萌發。

1.5 數據處理

采用Excel 2010 軟件進行數據統計；采用DPS軟件進行單因素方差分析；采用LSD 法進行多重比較及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同花粉活力測定方法比較

同一植物花粉在不同測定方法下，花粉活力差別較大。醋酸洋紅染色法與TTC 染色法差異顯著（P< 0.05），與離體萌發法差異極顯著（P< 0.01）；TTC 染色法與離體萌發法差異顯著（P< 0.05）（表1）。采用醋酸洋紅染色法，3 種山茶屬植物的花粉活力均在90%以上；采用TTC 染色法，杜鵑紅山茶的花粉活力最高（87.17%）；采用離體萌發法，3種山茶屬植物的花粉活力均在50%以下。

表1 不同測定方法下3種山茶屬植物的花粉活力Tab.1 Pollen viability of three Camellia plants by different methods(%)

2.2 不同培養基和培養溫度比較

不同培養溫度下，3種山茶屬植物花粉均在1號培養基上平均萌發率最高（表2）。在1號培養基上，崇左金花茶花粉在27 ℃下平均萌發率最高（44.32%），毛籽金花茶和杜鵑紅山茶花粉均在30 ℃下平均萌發率最高，分別為34.13%和22.39%。在25 ℃條件下，崇左金花茶和杜鵑紅山茶3 種培養基間均差異極顯著（P<0.01），毛籽金花茶1 號與2 和3 號培養基間均差異極顯著（P<0.01）；在27 ℃條件下，崇左金花茶和杜鵑紅山茶3 種培養基間均差異顯著（P< 0.05），毛籽金花茶1 號與2 和3 號培養基間均差異顯著（P< 0.05）；在30 ℃條件下，3 種山茶屬植物3種培養基間均差異顯著（P<0.05）。

表2 新鮮花粉萌發率Tab.2 Germination rates of fresh pollens(%)

2.3 不同貯藏條件下3種山茶屬植物的花粉活力

3種貯藏條件下，3種山茶屬植物的花粉活力均隨貯藏時間的延長逐步下降；4 和-18 ℃貯藏條件下的花粉活力大多數情況下極顯著高于室溫貯藏的花粉（P< 0.01）（表3～5）。室溫貯藏下，花粉活力下降最快；貯藏第20天，3種山茶屬植物的花粉活力分別降至31.57%、31.53%和34.90%；貯藏第120天，花粉活力分別降至2.95%、1.94%和2.03%；之后，花粉幾乎沒有活力。貯藏第180天，4 ℃貯藏條件下，3種山茶屬植物的花粉活力分別為73.12%、86.92%和79.22%；-18 ℃貯藏條件下，3 種山茶屬植物的花粉活力分別為79.13%、89.45%和82.01%。-18 ℃貯藏條件下的花粉活力優于4℃。

表3 不同貯藏條件下崇左金花茶的花粉活力Tab.3 Pollen viability of C.chuongtsoensis at different storage conditions(%)

表4 不同貯藏條件下毛籽金花茶的花粉活力Tab.4 Pollen viability of C.ptilosperma at different storage conditions(%)

表5 不同貯藏條件下杜鵑紅山茶的花粉活力Tab.5 Pollen viability of C.azalea at different storage conditions(%)

3 討論與結論

目前，常用的花粉活力檢測方法有染色法和萌發法。本研究中，采用離體萌發法測定出的崇左金花茶、毛籽金花茶和杜鵑紅山茶新鮮花粉活力明顯低于染色法，可能是由于染色法測定的是花粉潛在的活力，離體萌發法測定的是花粉的實際活力，有活力的花粉雖然有潛在萌發力但不一定會萌發；在實際工作中，染色法方便快捷，可用于快速檢測花粉活力，但有時活力較弱的花粉也會被染色，因此染色法測定的結果一般比實際情況高［16-17］，在鏡檢計數時，應注意區別染色深淺，減少誤差。

不同培養基成分和培養溫度對3種山茶屬植物花粉萌發率的影響較明顯。本研究中，1 號培養基（10%蔗糖+0.02%H3BO3）最適合3種山茶屬植物的花粉萌發。在1號培養基上，崇左金花茶新鮮花粉在27 ℃下培養3 h的萌發率為44.32%；周興文等[14]采用10%蔗糖+ 0.14%H3BO3為培養基，在27 ℃下培養3h，崇左金花茶新鮮花粉的萌發率為43.65%，兩者基本一致。在1號培養基上，毛籽金花茶和杜鵑紅山茶在30 ℃下培養3 h 的萌發率分別為34.13% 和22.39%；李天菲等[18]采用10%蔗糖+0.02%H3BO3為培養基，在25 ℃下培養2 h，杜鵑紅山茶新鮮花粉萌發率為40.30%；劉玉玲等[19]采用2.5%瓊脂+10%蔗糖為培養基，在25℃下培養8h，杜鵑紅山茶新鮮花粉萌發率為55.94%。本試驗結果低于其他兩個研究結果，可能是因為收集花粉的季節、培養溫度和培養時間等不同。

3 種山茶屬植物的花粉活力隨貯藏時間的延長逐步下降，室溫貯藏的下降速度比4 和-18 ℃條件下快。3 種山茶屬植物在4 和-18 ℃低溫條件下貯藏180 天，花粉活力仍在73.00%以上。有研究表明，茶花花粉保存在4 ℃左右的干燥環境下，花粉活力可持續0.5～1年；-20 ℃冷凍保存，花粉活力可持續兩年至兩年半的周期［20-21］。3 種山茶屬植物花粉活力，在室溫、4 ℃和-18 ℃條件下貯藏3 天，均比新鮮花粉活力低。為提高育種效率，在實際育種工作中，盡可能采用新鮮花粉進行授粉，若花期不遇，可在4 和-18 ℃條件下貯藏花粉，以-18 ℃貯藏為佳，盡快授粉。

采用醋酸洋紅染色法，3 種山茶屬植物的花粉活力均在90%以上；1 號培養基為最適合3 種山茶屬植物萌發的培養基；4和-18 ℃均為較好的花粉貯藏條件，-18 ℃條件下貯藏最佳。