不同根頸直徑苜蓿生理生化特性對低溫脅迫的響應

朱愛民， 黃衛麗， 韓國棟*， 張玉霞， 王顯國， 武 倩

(1. 內蒙古農業大學草原與資源環境學院， 草地資源教育部重點實驗室， 農業部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室， 內蒙古自治區草地管理與利用重點實驗室， 內蒙古 呼和浩特 010010； 2. 內蒙古自治區林業科學研究院， 內蒙古 呼和浩特 010010；3. 內蒙古民族大學農學院， 內蒙古 通遼 028041； 4. 中國農業大學動物科技學院， 北京 100083)

低溫不僅影響苜蓿(MedicagosativaL.)的地理分布，而且影響苜蓿人工草地的可持續利用。國內外學者對苜?？购匝芯枯^多[1-4]，研究表明，苜蓿的抗寒性與其根系保護酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶)活性強弱有關[5-9]?？芙ù宓萚10]、朱愛民等[11]研究表明，低溫鍛煉期苜蓿會通過增強根頸中抗氧化酶活性以抵御凍害。除苜蓿根頸中抗氧化酶活性與苜?？购悦芮邢嚓P外，苜蓿根頸中非結構碳氮也被認為是抗寒保護物質[12-14]。Krasnak等[15]研究表明，低溫脅迫會引起苜蓿根內的可溶性蛋白含量明顯升高，認為可溶性蛋白含量的增加有利于苜蓿根系抵御低溫脅迫，這與Trunova等[16]、Wldngm等[17]的研究結果相同。除了植物體中可溶性蛋白、可溶性糖外[18]，游離脯氨酸也是一種重要的滲透調節物質，在植物處于不利環境條件時(干旱、寒冷、高溫等)，其對維持細胞原生質與環境的滲透平衡具有重要作用[19]。在一定低溫脅迫范圍內，苜蓿能通過自身調節抵御低溫脅迫，但是苜蓿在不同低溫脅迫下發生怎樣的生理生化反應是需要進一步研究的問題。

苜蓿能否安全越冬不僅取決于自身抗寒能力的強弱，還受環境因素及種植管理水平的影響，適時早播對于提高苜蓿的抗寒性具有重要作用。早播苜?？梢猿浞值睦霉夂蜔?，能保證苜蓿正常的生長發育，根系生長粗壯更有利于其越冬。Schwab等[20]發現根頸越粗，苜蓿耐寒性越強。然而，對于根頸直徑對苜?？购缘呢暙I率以及苜?？购砩兓瘷C制尚不清楚，因此，本研究在實驗室中對不同根頸直徑苜蓿根系低溫脅迫處理，分析了低溫脅迫對不同頸粗苜蓿根頸生理生化指標的影響，以期探明不同根頸直徑苜?？购缘纳砩瘷C制，這將對指導北方寒冷地區苜蓿的高效生產具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗區自然概況

試驗地位于內蒙古自治區赤峰市阿魯科爾沁旗牧草生產基地，地理位置為42°30′50″ N，115°27′34″ E。試驗地土壤營養成分見表1。

表1 試驗地土壤養分含量Table 1 Soil nutrient content of the test site

1.2 供試材料

試驗材料是由吉林省農業科學院草地研究所提供的‘公農1號’紫花苜蓿品種(MedicagosativaL. ‘Gongnong No.1’)。

1.3 試驗設計

大田試驗設計：于2017年7月1日采用機械條播的方式進行播種，苜蓿播種量為22.5 kg·hm-2。2017年11月10日土壤凍融期對苜蓿根系取樣，挖取苜蓿根系的深度約為20 cm。在實驗室中用游標卡尺對紫花苜蓿根頸0.5 cm處進行測量，將苜蓿分成根頸直徑大小分別為3.50 mm,5.25 mm,7.00 mm的3個類別，并于4℃恒溫冰箱低溫保存。

低溫處理試驗設計：將備用的3種直徑大小(3.50 mm,5.25 mm,7.00 mm)苜蓿越冬器官用蒸餾水沖洗干凈。共12個處理(3個苜蓿根頸直徑、4個低溫處理溫度)，每個處理3個重復，每個重復10株苜蓿根系，根系長度均控制為15 cm。將根系并排整齊地擺放在厚度為3 mm，長、寬為30 cm×20 cm的脫脂棉上，包裹好后分別均勻噴灑20 mL蒸餾水，最后用長、寬為30 cm×30 cm的錫箔紙包好。放在4℃恒溫冰箱中的苜蓿材料作為對照，其他處理放入低溫程控箱中進行低溫處理，處理目標溫度分別為-10℃，-15℃和-20℃。低溫程控箱設置為：以4℃為起點，先以4℃·h-1的速率降溫，到達設定溫度后保持6 h，之后以4℃·h-1的速率升溫達到室溫后取出置于4℃下保持12 h，然后進行相關指標的測定[21-22]。

1.4 測定項目及方法

用刀片對低溫處理后的苜蓿根頸0～0.5 cm處取樣，并切片，進行根頸活力、非結構碳氮和抗氧化酶活性的測定。根系活力測定用TTC染色法測定[23]。其他生理生化指標采用鄒琦[24]和郝再彬[25]的測定方法：可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；淀粉含量采用蒽酮比色法測定；游離氨基酸含量采用茚三酮染色法測定；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑法測定；過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測定；過氧化物酶(POD)采用愈創木酚法測定。

公式中C指苜蓿根頸中的可溶性糖和淀粉含量，N指根頸中的游離氨基酸和可溶性蛋白含量。

1.5 數據分析

使用Microsoft excel軟件對數據進行計算，并制作表格。采用SPSS17.0軟件對根頸活性、抗氧化酶活性和非結構碳氮等指標做雙因素(溫度和根頸直徑)方差顯著性分析，并對不同低溫處理下不同頸粗苜蓿根頸生理生化指標與根頸活力做相關性分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對不同根頸直徑苜蓿生理生化特性的影響

2.1.1溫度、根頸直徑及交互作用對苜蓿根頸生理生化指標的影響 由表2可知，不同根頸直徑的苜蓿在低溫脅迫下其生理生化指標變化明顯，其中根頸直徑對苜蓿根頸活力及根頸中SOD活性有顯著影響(P<0.05)，對根頸中可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白及C/N具有極顯著影響(P<0.01)。除SOD和POD外，低溫脅迫對苜蓿根頸活力、根頸中非結構碳氮、C/N及CAT活性均有極顯著影響(P<0.01)。溫度和根頸直徑的交互作用對苜蓿根頸活力、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和非結構碳氮比具有顯著影響(P<0.05)，對淀粉含量有極顯著影響(P<0.01)。

表2 溫度、根頸直徑及交互作用對苜蓿根頸生理生化指標的影響Table 2 Effects of low temperature,root collar diameter and interaction on physiological and biochemical indexes of alfalfa root collar

2.2 低溫處理對不同根頸直徑苜蓿根頸活力的影響

由表3可知，隨低溫脅迫強度的加劇不同根頸直徑的苜蓿根頸活力均呈逐漸降低的變化趨勢。4℃和-10℃處理下的苜蓿根莖活力差異不顯著，但均顯著大于-15℃和-20℃處理(P<0.05)。其中3.5 cm頸粗的苜蓿在-15℃脅迫下，比-10℃脅迫根頸活力下降了78.1%，下降幅度較大，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿在-10℃至-15℃脅迫下根頸活力下降幅度分別為52.2%,35.0%。4℃和-20℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸活力顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)，在-10℃處理下不同頸粗苜蓿根頸活力差異不顯著，-20℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗苜蓿的根頸活力顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)。

表3 低溫處理對不同根頸直徑苜蓿根頸活力的影響Table 3 Effect of low temperature treatment on root collar activity of alfalfa with different root collar diameters 單位：μg·g-1·h-1

2.3 低溫處理對不同根頸直徑苜蓿根頸非結構碳氮含量及C/N的影響

由表4可知，隨低溫脅迫強度的加劇不同頸粗的苜蓿根頸中可溶性糖含量均呈增加-降低-增加的變化趨勢，先在-10℃處理下達到一個峰值，后在-15℃處理下降低，在-20℃處理下又顯著增加。除-20℃外，其他低溫處理下3.5 cm和7 cm頸粗的苜蓿根頸中的可溶性糖含量均大于5.25 cm頸粗的苜蓿，且在-10℃下差異達到顯著水平(P<0.05)。

表4 低溫處理對不同根頸直徑苜蓿根頸非結構碳氮含量及C/N的影響Table 4 Effects of low temperature treatment on the content of non-structural carbon and nitrogen and C/N ratio of alfalfa with different collar diameters

隨低溫脅迫強度的加劇不同頸粗的苜蓿根頸中淀粉含量均呈先增加后降低的變化趨勢，其中3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿在-15℃下根頸中的淀粉含量達到最高，而7 cm頸粗的苜蓿在-10℃下達到最大。-10℃和-15℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸中淀粉含量均顯著大于4℃和-20℃處理，-10℃處理下7 cm頸粗的苜蓿根頸中淀粉含量顯著大于4℃,-15℃和-20℃。4℃和-10℃處理下3.5 cm和7 cm頸粗苜蓿根頸淀粉含量顯著大于5.25 cm頸粗的苜蓿，而-15℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸淀粉含量顯著大于7 cm頸粗的苜蓿。

隨低溫脅迫強度的加劇不同頸粗苜蓿根頸中游離氨基酸的含量均呈先降低后增加的變化趨勢，3.5 cm頸粗的苜蓿在-15℃處理下最低，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿在-10℃下最低。-10℃和-15℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中游離氨基酸含量顯著大于7 cm頸粗的苜蓿，但與5.25 cm頸粗的苜蓿相比差異不顯著。

不同頸粗苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量變化與可溶性糖含量變化趨勢一致，隨低溫脅迫強度的加劇呈增加-降低-增加的變化。苜蓿根頸中可溶性蛋白含量均在-15℃下達到最低，顯著低于4℃和-10℃處理。4℃和-10℃處理下5.25 cm和7 cm頸粗苜蓿根頸中可溶性蛋白含量顯著大于3.5 cm頸粗的苜蓿。

隨低溫脅迫強度的加劇不同頸粗苜蓿根頸中的C/N均呈先增加后降低的變化趨勢，C/N均在-15℃下達到最大。-15℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中C/N顯著大于4℃和-20℃，5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿根頸中的C/N在-15℃和-20℃處理顯著大于4℃，-10℃處理。4℃和-10℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中C/N顯著大于5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿。

2.4 低溫處理對不同根頸直徑苜蓿根頸抗氧化酶活性的影響

由表5可知，隨低溫脅迫強度的加劇，3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中SOD活性呈先增加后降低的變化，在-15℃處理下達到最大，5.25 cm頸粗的苜蓿呈逐漸增加的變化，在-20℃處理下最大，7 cm頸粗的苜蓿在4℃,-15℃處理下較高，顯著大于-20℃處理(P<0.05)。隨苜蓿根頸直徑的增加，4℃處理下苜蓿根頸中SOD活性逐漸增加，-10℃和-15℃處理下根頸中SOD活性逐漸降低，-20℃處理下根頸中SOD活性呈先增加后降低變化。

表5 低溫處理對不同根頸直徑苜蓿根頸抗氧化酶活性的影響Table 5 The effect of low temperature treatment on antioxidant enzyme activity of alfalfa root collar with different diameters

4℃和-20℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸中POD活性顯著大于-10℃處理(P<0.05)。4℃處理下3.5 cm頸粗的苜蓿根頸POD活性顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)，但與5.25 cm頸粗的苜蓿相比差異不顯著。-10℃處理下5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿根頸POD活性顯著大于3.25 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)。

隨低溫脅迫強度的加劇不同頸粗苜蓿根頸中CAT活性均呈先增加后降低的變化趨勢，3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸CAT活性在-10℃處理下最高，而7 cm頸粗的活性則在-15℃下達到最大。-15℃處理下7 cm頸粗的苜蓿根頸中CAT活性顯著大于3.5 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)，-20℃處理下3.5 cm和5.25 cm頸粗的苜蓿根頸中CAT活性顯著大于7 cm頸粗的苜蓿(P<0.05)。

2.5 根頸直徑、溫度和根頸活力與非結構碳氮及抗氧化酶活性的相關性分析

相關性分析表明(表6)，苜蓿根頸直徑大小與根頸中的可溶性蛋白含量呈顯著的正相關關系。溫度高低與苜蓿根頸中可溶性糖含量呈顯著的負相關關系，與可溶性蛋白含量呈顯著的正相關關系，與根頸中C/N比呈極顯著的負相關關系。

表6 根頸直徑、溫度與非結構碳氮含量、C/N及抗氧化酶活性的相關性分析Table 6 Correlation analysis of C/N ratio,non-structural carbon,nitrogen and antioxidant enzyme activity with temperature and root collar diameter

由表7可知，苜蓿根頸活力與根頸中可溶性糖含量呈顯著的負相關關系，與可溶性蛋白含量呈極顯著的正相關關系，與CAT活性呈顯著的正相關關系，與根頸中C/N呈極顯著的負相關關系。

表7 苜蓿根頸活力與根頸中非結構碳氮及抗氧化酶活性的相關性分析Table 7 Correlation analysis of alfalfa root collar activity with non-structural carbon,nitrogen and antioxidant enzyme activities in root collar

3 討論

根頸活力是判斷植物抗寒性大小的重要指標[27-28]，研究表明[22]，低溫脅迫后苜蓿植株根頸活力會明顯下降，通過測定苜蓿根頸活力的大小可以判斷苜?？购缘膹娙?。本研究表明，苜蓿根頸活力對低溫的響應極其敏感，根頸直徑較小的苜蓿耐受低溫的能力小，說明根頸直徑小的苜?？购暂^弱，根頸直徑較大的苜?？购暂^強。

前人的研究表明[16-17]，苜蓿根頸中可溶性糖、可溶性蛋白及游離氨基酸含量的升高有利于苜?？购缘脑鰪?。本研究中，根頸直徑和低溫脅迫對苜蓿根頸中可溶性糖和可溶性蛋白含量均有顯著影響，但兩個因素交互作用影響卻未達到顯著水平。說明根頸直徑較粗的苜?？赡軙ㄟ^調節根頸中可溶性糖和可溶性蛋白含量的降低以消除低溫脅迫的影響。C/N間接反映植物組織中非結構碳氮物質含量，是衡量植物抗逆性的重要指標，研究表明植物根系C/N越高對植物越冬越有利[29]。本研究發現不同頸粗的苜蓿根頸中可溶性糖和可溶性蛋白含量隨溫度的降低變化趨勢一致，但游離氨基酸含量變化趨勢則不同，說明不同頸粗苜蓿在低溫脅迫下調節根頸中非結構碳氮含量的能力不同。研究表明[22,30]，苜蓿耐受低溫脅迫的能力是有限的，即一定溫度的低溫脅迫條件下苜蓿能通過自身的生理生化調節以適應低溫環境，當溫度超過苜蓿耐受低溫脅迫的極限時，苜蓿根系將會受到凍傷或凍害。本研究中不同頸粗苜蓿根頸中CAT活性與非結構碳氮比變化趨勢一致，均呈先增加后降低的變化趨勢，但不同頸粗的苜蓿根頸中CAT活性最強處的脅迫溫度不同。說明根頸中CAT參與了苜蓿抵御低溫脅迫的自身調節過程，且不同頸粗苜蓿耐低溫和調控能力不同[9,11]。

相關性分析和雙因素方差分析均表明苜蓿根頸可溶性蛋白含量與苜蓿根頸大小密切相關，溫度和根頸活力與可溶性糖、可溶性蛋白、CAT活性和C/N關系密切，說明不同根頸直徑的苜蓿在受到低溫脅迫時通過調控根頸中可溶性蛋白、可溶性糖、CAT活性和C/N以適應或抵御低溫脅迫[11,26,31]。結合根頸活力值的變化及不同頸粗苜蓿根頸中生理生化指標變化的拐點溫度，研究認為，當在目標溫度低溫脅迫處理6 h時，3.5 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限溫度在-10℃至-15℃之間，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限在-15℃至-20℃之間。在一定低溫脅迫范圍內，苜蓿通過增加根頸中CAT活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及調節根頸中的非結構碳氮比以抵御低溫脅迫，但當低溫脅迫溫度超過苜蓿的耐受極限時則苜蓿根頸中CAT活性會迅速降低逐漸失活，而可溶性蛋白和可溶性糖含量則會先降低后迅速增加，這可能與根頸中可溶性糖和可溶性蛋白進一步水解有關[32]，仍需進一步的研究加以佐證。

4 結論

苜蓿通過調控根頸中可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過氧化氫酶活性和非結構碳氮比以適應或抵御低溫脅迫，根頸直徑小的苜蓿調控能力較弱，根頸直徑較大的苜蓿調控能力較大。當在目標溫度低溫脅迫處理6 h時，3.5 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限溫度在-10℃至-15℃之間，而5.25 cm和7 cm頸粗的苜蓿耐受低溫的極限在-15℃至-20℃之間。