低產乙醇本土有孢漢遜酵母的篩選及釀造特性

馮文倩，王倩,2，劉延琳,2，宋育陽,2，姜嬌,2，伍新宇，秦義,2*

1(西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌，712100) 2(西北農林科技大學合陽葡萄試驗示范站，陜西 合陽，715300) 3(新疆農業科學院園藝作物研究所，新疆 烏魯木齊，830043)

由于全球氣候變暖，葡萄成熟時的含糖量越來越高，導致葡萄酒酒度不斷升高[1]。在過去30年的時間里，全球葡萄酒的酒精度平均上升了約2%(乙醇體積分數，下同)[2-3]。在我國西北部分葡萄酒產區，特別是近10年來，葡萄完全成熟時的含糖量甚至超過270 g/L，從而導致葡萄酒最終酒精度超過15%。較高的酒精度不利于酒體平衡，也影響葡萄酒的香氣和風味[4]。利用葡萄栽培技術、葡萄酒物理脫醇技術和微生物技術等，可以在一定程度上降低葡萄酒的酒精度[5-6]，這其中，選育具有低產乙醇的酵母菌株將是最簡單和經濟的方法。有研究顯示，假絲酵母屬(Candida)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、美奇酵母屬(Metschnikowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、Starmerella和Lachancea等酵母屬的部分菌株具有低產乙醇的特性，可以使葡萄酒的酒精度降低0.3%～3.8%[7-11]。

Hanseniaspora主要包括葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntiae)、季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)、葡萄園有孢漢遜酵母(Hanseniasporavineae)等。有研究表明H.uvarum的純種或混合發酵可以降低酒精含量，同時產生較低的揮發酸和更高的甘油、有機酸、醛類、醇類等次級代謝產物[12]。ROSSOUW等[10]利用H.opuntiae和H.uvarum發酵Pinotage，酒精度分別降低了0.6%和0.8%。GOBBI等[13]使用H.uvarum單獨發酵Verdicchio和Trebbiano，可使乙醇產量降低32.9%。ZHU等[14]篩選到2株乙醇產量及產率均低于釀酒酵母的H.uvarum06/4菌株，其乙醇產量減少了10%。但同時，大部分有孢漢遜酵母在葡萄酒生境下的生長能力較弱，因為較高的葡萄含糖量、酒精度的增加、發酵溫度的變化、SO2的添加等都可能會抑制有孢漢遜酵母的生長。

我國葡萄酒產區分布廣、生態多樣，蘊藏著豐富的有待開發的非釀酒酵母資源，而有孢漢遜酵母屬酵母是葡萄表皮和葡萄酒發酵早期主要的“土著”酵母屬，因此本研究以有孢漢遜酵母屬酵母為研究對象。為了獲得低產乙醇且釀造特性較好的本土有孢漢遜酵母菌株，本研究以從寧夏、甘肅、陜西和新疆分離獲得的53株有孢漢遜酵母為材料，首先利用模擬葡萄汁發酵，篩選出乙醇產率較低和生長速率較快的有孢漢遜酵母，并對其糖、乙醇、SO2、低pH、溫度耐受性、嗜殺性和產H2S特性等葡萄酒釀造學特性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

53株本土有孢漢遜酵母(分離自寧夏、甘肅、陜西和新疆)和1株釀酒酵母(分離自寧夏)，均保藏于西北農林科技大學葡萄酒學院，如表1所示。

表1 本研究使用的本土酵母菌株Table 1 Indigenous yeast strains used in this study

1.1.2 培養基

YEPD培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，121 ℃高壓滅菌20 min。

YEPD-MB培養基(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，瓊脂20，亞甲基藍0.03，0.2 mol/L 磷酸檸檬酸緩沖溶液調pH值至4.6，121 ℃高壓滅菌20 min。

Triple M模擬汁[15]：葡萄糖100 g/L，果糖100 g/L，4 mL/L ergo stock(Tween-80 12.5 mL，95%乙醇 37.5 mL，麥角固醇 0.125 g)；L-(+)酒石酸 6 g/L，L-(-)蘋果酸 3 g/L，檸檬酸0.5 g/L；YNB 1.7 g/L，酸水解酪蛋白2 g/L，肌醇0.006 g/L，CaCl20.2 g/L，L-脯氨酸1 g/L，DL-色氨酸0.1 g/L，精氨酸0.8 g/L，(NH4)3PO41 g/L。KOH溶液調pH值至3.25，0.22 μm濾膜過濾除菌。

WL營養瓊脂，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；BIGGY瓊脂，北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

ZHWY—2102C恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；AUX320分析天平，日本SHIMADZU公司；SX-500立式壓力蒸汽滅菌器，中國Techcomp公司；ELX800全自動酶標儀，美國Bio Tek公司；BK1301生物顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；Spectra Max M2多功能微孔板檢測儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母培養

將保藏的酵母菌液劃線于WL營養瓊脂培養基，28 ℃下培養3～5 d。在WL營養瓊脂培養基上挑取單菌落接種于YEPD液體培養基中，于28 ℃、150 r/min的條件下培養24 h制備酵母種子液。

1.3.2 低產乙醇有孢漢遜酵母的篩選

將53株有孢漢遜酵母及對照菌株釀酒酵母NX11424的活化菌液以2%的接種量接種于50 mL 模擬汁中，28 ℃、150 r/min擴大培養24 h，然后再將擴大培養的菌液以1×106CFU/mL的接種量接種到裝有150 mL模擬葡萄汁的250 mL發酵瓶中發酵，發酵瓶用封口膜密封，25 ℃靜置發酵，每個菌株設置3組平行。發酵過程中，每隔8 h對釀酒酵母取樣測定殘糖和CO2失重，每24 h測定有孢漢遜酵母的CO2失重。當糖含量<4 g/L或連續72 h CO2失重不再變化時視為發酵結束。發酵結束后，通過比較各菌株的CO2失重速率、乙醇產量、乙醇產率、乙醇產率的變化率等指標，篩選獲得低產乙醇的有孢漢遜酵母。

1.3.3 低產乙醇有孢漢遜酵母的發酵驗證

為進一步確定所篩選有孢漢遜酵母的低產乙醇特性，將其和對照菌株NX11424再次進行模擬發酵。

將待測有孢漢遜酵母及對照菌株釀酒酵母NX11424的活化菌液，以2%的接種量接種于50 mL模擬汁中，28 ℃、150 r/min擴大培養24 h，然后再將擴大培養的菌液以1×106CFU/mL的接種量接種到裝有150 mL模擬葡萄汁的250 mL發酵瓶中發酵，發酵瓶用封口膜密封，25 ℃靜置發酵，每個菌株設置3組平行。利用移液槍在超凈工作臺進行無菌取樣，每次取樣體積均等且控制在1 mL。通過測定發酵液的還原糖含量監控發酵過程(釀酒酵母：每24 h測定1次；有孢漢遜酵母：發酵前期，每48 h測定1次，發酵后期，每72 h測定1次)。發酵結束后，測定各菌株的理化指標。

1.3.4 優選有孢漢遜酵母的系統發育樹構建

采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進行26S rDNA D1/D2區的擴增。PCR擴增液送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將測序結果在NCBI數據庫中用BLAST軟件與已知序列進行同源比對分析。根據同源序列搜索結果，用Clustal X軟件對優選菌株和相關模式菌株的多個序列進行匹配分析(Alignment)，利用MEGA 7.0構建系統發育樹，并進行1 000次Bootstrap檢驗。

1.3.5 四株有孢漢遜酵母菌株的工藝學性狀

1.3.5.1 糖耐受性

在YEPD液體培養基中加入葡萄糖，使其葡萄糖質量濃度分別為100、150、200、250、300、350 和400 g/L，經過濾除菌后，將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于培養基中，28 ℃條件下培養48 h，使用酶標儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.2 酒精耐受性

在滅菌之后的YEPD液體培養基中加入無水乙醇調整乙醇體積分數為2%、4%、6%、8%、10%，將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于培養基中，28 ℃條件下培養48 h，使用酶標儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.3 SO2耐受性

在滅菌之后的YEPD液體培養基中加入H2SO3調整SO2質量濃度為60、120、180、240、300、360和420 mg/L，將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于培養基中，28 ℃條件下培養48 h，使用酶標儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.4 溫度耐受性

將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于已滅菌的YEPD液體培養基中，分別置于溫度為10、15、20、25、30、35和40 ℃的培養箱中，28 ℃條件下培養48 h，使用酶標儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.5 低pH耐受性

用磷酸-檸檬酸緩沖液調節YEPD液體培養基的pH值分別為2.8、3.2、3.6、4.0，滅菌后接種酵母種子液，接種量為1×106CFU/mL，28 ℃條件下培養48 h，使用酶標儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.6 酵母嗜殺性測定

將釀酒酵母NX11424細胞計數后用無菌水稀釋至107CFU/mL后涂布于YEPD-MB培養基，然后取5 μL非釀酒酵母菌液點樣在涂有釀酒酵母的YEPD-MB培養基上，28 ℃恒溫培養2 d。若非釀酒酵母菌株為嗜殺菌株，其菌落周圍會形成藍色死菌帶和透明抑菌圈[16]。

1.3.5.7 酵母產H2S特性檢驗

將5 μL非釀酒酵母菌液點樣于BIGGY培養基上，28 ℃恒溫培養3～5 d，觀察菌落顏色。一般H2S產量由低到高對應菌落顏色分別為白色(不產)、黃棕色(低產)、褐色(中產)和黑色(高產)[17]。

1.3.6 理化指標測定

利用酶標儀測定樣品在600 nm波長下的OD值；采用DNS法[18]測定殘糖的含量。按照Megazyme乙醇試劑盒(K-ETOH)和BioSystems甘油試劑盒分別檢測乙醇和甘油。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測定總酸和揮發酸。

1.4 數據處理與指標計算

1.4.1 數據處理

利用Excel 2016進行發酵數據統計。采用SPSS 20.0進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多范圍檢驗以確定數據之間的顯著差異(P<0.05)。利用Origin Pro 2018作圖。

1.4.2 指標計算

乙醇產量/(g·L-1)=φ(乙醇)×10×0.789

(1)

式中：0.789為乙醇密度，g/mL[13]。

(2)

(3)

式中：A，供試有孢漢遜酵母發酵結束時的乙醇產率；B，當釀酒酵母與供試有孢漢遜酵母消耗相同糖時，釀酒酵母的乙醇產率。

2 結果與分析

2.1 低產乙醇有孢漢遜酵母菌株的篩選

對53株本土有孢漢遜酵母進行模擬葡萄汁發酵，以乙醇產率作為主要評價指標，以S.cerevisiaeNX11424為對照菌株，評估了有孢漢遜酵母菌株的產乙醇能力(表2)。有孢漢遜酵母的CO2最大失重速率明顯低于S.cerevisiaeNX11424，其中，葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)HuD-2-2的發酵速率較快，CO2最大失重速率達到0.48 g/(L·h)。有孢漢遜酵母的乙醇產率介于0.185～0.494 g/g，而S.cerevisiaeNX11424的乙醇產率為0.404 g/g。53株有孢漢遜酵母中，有28株酵母的乙醇產率低于S.cerevisiaeNX11424，降低幅度為3.78%～39.52%。

綜合分析CO2最大失重速率、糖利用率、乙醇產率及乙醇產率的變化率等指標，初步篩選出4株低產乙醇且發酵速率較快的菌株，分別為H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2，其進化關系如圖1所示。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2的糖利用率分別為86.94%、90.13%和98.77%、87.69%，乙醇產率分別降低了26.03%、22.33%和23.77%、32.05%。

表2 菌株的發酵相關參數Table 2 Fermentation parameters of the strains

續表1

圖1 四株有孢漢遜酵母的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of four Hanseniaspora strains

2.2 低產乙醇有孢漢遜酵母的進一步發酵驗證

為了進一步驗證篩選獲得的4株有孢漢遜酵母菌株的乙醇合成能力，再次進行模擬葡萄汁發酵。

2.2.1 四株有孢漢遜酵母菌株的發酵動力學特征

當發酵進行到12 d時，4株有孢漢遜酵母逐漸適應了模擬葡萄汁環境，發酵速度均明顯加快，其中H.uvarumHuC-3-2的糖消耗速率最快，并于第21天完成發酵；H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2的發酵趨勢基本一致，發酵能力稍弱于H.uvarumHuC-3-2；H.opuntiaeHoA-1-3的發酵能力最弱，在30 d內不能完成發酵(圖2-a和圖2-b)。盡管H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2均可以單獨完成葡萄模擬汁發酵，但在真實葡萄酒發酵過程中，通常需要將有孢漢遜酵母和釀酒酵母進行混合接種發酵。

4株有孢漢遜酵母的乙醇產量明顯低于NX11424，其中H.opuntiaeHoA-1-3的乙醇產生速率最慢，其他3株有孢漢遜酵母產乙醇速率的趨勢相似(圖2-c)。發酵結束后，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2的酒精度分別為6.41%、8.47%、9.38%和8.48%。

2.2.2 四株有孢漢遜酵母菌株的代謝物

除H.opuntiaeHoA-1-3外，其他菌株的殘糖含量均在4 g/L以下。5株酵母菌株的酒精度和乙醇產率分別為6.41%～10.41%(體積分數)和0.317～0.417 g/g。與S.cerevisiaeNX11424相比，H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2的乙醇產率分別降低了23.87%、19.25%和10.74%、18.74%(表3)。

H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2的甘油產量均高于菌株S.cerevisiaeNX11424，分別增加了2.3%、4.7%和5.9%。此外，4株有孢漢遜酵母的揮發酸均高于S.cerevisiaeNX11424，揮發酸含量增加了12.3%～38.6%。甘油和揮發酸產量的增加，說明發酵底物碳源有更多的碳流向了甘油和乙酸的合成，這可能是4株有孢漢遜酵母乙醇產率降低的重要原因。

此外，模擬葡萄汁的總酸含量為9.0 g/L(以酒石酸計)，發酵結束后，4株有孢漢遜酵母的降酸幅度(23.22%～27.78%)均高于S.cerevisiaeNX11424(20.67%)。因此，本研究篩選的4株有孢漢遜酵母在葡萄酒降酸方面也具有一定的應用潛力。

2.3 四株有孢漢遜酵母菌株的釀造特性

2.3.1 糖耐受性

較高糖質量濃度的葡萄汁會抑制酵母菌的生長，從而延長發酵時間[20]，而且高滲透壓也會影響酒精發酵的代謝產物，如乙酸合成量的增加等[21]。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2均能夠耐受400 g/L的初始葡萄糖質量濃度，但當初始糖質量濃度>300 g/L時，4株酵母的生長量呈現下降趨勢(圖3)。其中，H.opuntiaeHoA-1-3和H.uvarumHuB-2-2在初始糖質量濃度為250 g/L時表現出生長抑制，H.uvarumHuC-3-2和H.opuntiaeHoC-4-2分別在初始糖質量濃度為300和350 g/L時表現出生長抑制。綜合看來，H.opuntiaeHoA-1-3和HoC-4-2對高糖具有較好的耐受性，這對于高糖葡萄汁發酵的順利進行具有重要意義。

2.3.2 酒精耐受性

酒精耐受性是酵母菌株重要的葡萄酒工藝學性狀。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2的生長受到高酒精含量的顯著抑制(圖4)。H.opuntiaeHoA-1-3和H.opuntiaeHoC-4-2可以耐受6%(體積分數)的酒精度，而H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2僅能耐受4%的酒精度。當酒精度>6%時，4株有孢漢遜酵母盡管仍可以生長，但是生長趨勢極其微弱。在這部分的試驗中出現了一個有意思的現象，即4株有孢漢遜酵母在YEPD培養基中酒精耐受性較弱，但是在模擬葡萄汁中卻能產生8%以上的酒精，這可能是由于4株有孢漢遜酵母在10余天的模擬葡萄汁發酵過程中經歷了一個酒精度逐漸升高的適應性馴化，這也間接反應出這4株有孢漢遜酵母可能比較容易使用適應性馴化或者理化誘變等方法進行育種。

圖4 有孢漢遜酵母菌株的酒精耐受性Fig.4 Ethanol tolerance of the Hanseniaspora strains

對這4株有孢漢遜酵母開展以提高發酵速度為目標的常壓室溫等離子體誘變育種，初步證實了上述猜想，1次誘變即可獲得大量的發酵速度加快的正向突變菌株。

2.3.3 SO2耐受性

如圖5所示，4株有孢漢遜酵母菌株在SO2質量濃度<300 mg/L時均能很好地生長，且在不同質量濃度下的生長沒有明顯差異。當SO2質量濃度達到360 mg/L時，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2的生長幾乎被完全抑制，但H.uvarumHuC-3-2在SO2質量濃度達到420 mg/L時，生長才受到完全抑制。在葡萄原料衛生狀況良好的情況下，釀造干型葡萄酒添加的SO2通常不超過60 mg/L。因此，從生產應用的角度來看，SO2不是限制這些菌株應用的因素。

圖5 有孢漢遜酵母菌株的SO2耐受性Fig.5 SO2 tolerance of the Hanseniaspora strains

2.3.4 溫度耐受性

發酵溫度是決定葡萄酒質量的重要因素，酵母生長的最適溫度不同，低溫和高溫都會影響酵母菌的生長繁殖和發酵速率[22]。在葡萄酒釀造過程中，高溫菌株將提高發酵臨界溫度，降低發酵停滯的風險，而漢遜酵母屬是耐高溫酵母屬之一[23]。由圖6可知，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2都能在40 ℃高溫條件下正常生長，H.uvarumHuC-3-2的生長較弱。有研究表明部分非釀酒酵母比釀酒酵母能更好地在10～15 ℃的低溫條件下發酵，發酵前的冷浸漬也有利于有孢漢遜酵母的生長[24-25]，而本研究的4株有孢漢遜酵母菌株均能在10 ℃的低溫下生長，且當培養溫度為20 ℃時，菌株的生長量均達到最大值。

2.3.5 低pH耐受性

葡萄汁的pH值通常在3.0～4.0[20]，因此葡萄酒釀造用酵母菌需要具有較強的耐酸性能。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2在pH 2.8～4.0均能很好的生長，尤其是H.uvarumHuC-3-2在不同pH值條件下的生長量均高于其他菌株(圖7)，因此，從pH值耐受性角度看，本研究的4株有孢漢遜酵母菌均可滿足葡萄酒生產要求。

圖6 有孢漢遜酵母菌株的溫度耐受性Fig.6 Temperature tolerance of the Hanseniaspora strains

圖7 有孢漢遜酵母菌株的pH耐受性Fig.7 pH tolerance of the Hanseniaspora strains

2.3.6 嗜殺特性

嗜殺酵母在其生長繁殖過程中會分泌嗜殺毒素，但對自身產生的毒素具有免疫功能[26]。4株有孢漢遜酵母周圍均未出現藍色抑菌圈，說明這4株有孢漢遜酵母對S.cerevisiaeNX11424均無嗜殺作用(圖8)。對S.cerevisiae沒有嗜殺活性，將有利于這4株有孢漢遜酵母和S.cerevisiae進行混合發酵。

圖8 有孢漢遜酵母菌株的嗜殺性Fig.8 Killing activity of the Hanseniaspora strains

2.3.7 產H2S特性

H2S具有較強的揮發性，較低的嗅覺閾值(50～80 μg/L)，過高會使葡萄酒具有臭雞蛋氣味，影響葡萄酒的香氣質量，破壞葡萄酒的風味[18]。5株酵母菌株在BIGGY培養基上的顯色如圖9所示，S.cerevisiaeNX11424和H.uvarumHuB-2-2屬于中產H2S菌株，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuC-3-2均為不產H2S菌株。

圖9 酵母菌株的產H2S特性Fig.9 H2S production capacity of the yeast strains

3 結論

本研究以寧夏、甘肅、陜西和新疆葡萄酒產區分離的53株有孢漢遜酵母為研究對象，利用模擬葡萄汁發酵篩選獲得H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2等4株具有低產乙醇性狀的有孢漢遜酵母屬酵母，其乙醇產率分別降低23.87%、19.25%、10.74%和18.74%。4株有孢漢遜酵母均能耐受400 g/L的糖、300 mg/L的SO2、pH 2.8、10 ℃低溫和40 ℃高溫，均無嗜殺活性；除H.uvarumHuB-2-2外，其他3株有孢漢遜酵母均不產H2S。整體而言，本研究篩選獲得的H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuC-3-2在低產乙醇的同時，還具有較好的生長特性、耐受能力、發酵性能等釀造學特性，具有一定的應用價值。

為了將其應用于真實的葡萄酒釀造，在后續的研究工作中，一方面需要進一步研究4株有孢漢遜酵母與釀酒酵母的混合發酵技術，以及其對葡萄酒感官質量的影響；另外，可以這4株有孢漢遜酵母為出發菌株，通過物理化學誘變或者適應性進化等育種手段，選育具有更優秀釀造學特征的低產乙醇酵母菌株，從而實現在生產中的推廣應用。