聚谷氨酸去除馬鈴薯廢水蛋白質及絮凝機理初探

牛雅倩，李雨桐，趙娟，張琳，盧文明，喬長晟,,5,6*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津科技大學 現代分析技術研究中心，天津，300457) 3(天津慧智百川生物工程有限公司，天津，300457)4(內蒙古蒙森農業股份科技有限公司，內蒙古 赤峰，024000) 5(工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室，天津，300457) 6(天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津，300457)

馬鈴薯淀粉生產廢水是馬鈴薯淀粉以及相關淀粉產品生產過程中產生的廢液，是一種高濃度的有機廢水[1]，平均每生產1 t淀粉,需排放20 t左右的廢水，其中需要處理的含蛋白質廢水約5 t左右，直接排放不但會造成資源浪費，還會帶來環境污染問題[2-4]。馬鈴薯淀粉廢水中含有淀粉、蛋白質、纖維素等有機物[5]，基本沒有毒性，具有高泡沫、高濃度、高濁度的“三高”特點，不能直接排放[6]。

未經處理的馬鈴薯淀粉生產廢水會產生臭味氣體。其中無機的惡臭污染物有硫化合物、氮化合物等；有機的惡臭污染物有鏈烴、芳香烴等[7-9]。馬鈴薯蛋白是造成廢水惡臭和氨氮含量超標的主要原因，回收馬鈴薯蛋白，不僅可有效降低氨氮含量,減小臭味，同時有利于降低化學需氧量(chemical oxygen demand, COD)和濁度[10]，也有利于廢水的回田灌溉[11]，對馬鈴薯行業具有現實意義。

常見的絮凝劑有機絮凝劑和無機絮凝劑。有機高分子絮凝劑用量少，但不易被生物分解。聚丙烯酰胺會生成N-亞硝胺類消毒副產物，一種新型的含氮消毒副產物,其潛在的致癌、致畸和致突變性風險引起了國內外學者的廣泛關注[12-13]。常見的無機絮凝劑為鋁鹽化合物類以及鐵鹽類絮凝劑。鋁鹽類化合物進入人體內,會導致人體出現中毒癥狀,嚴重的還會導致老年癡呆[14]。鐵鹽化合物類絮凝劑會對鐵質設備造成嚴重腐蝕,且具有明顯的顏色變化, 在具體應用過程中,具有很大的局限性[14]。而聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)作為一種新型的微生物絮凝劑,具有生物可降解性、水溶性、無毒等特點。采用聚谷氨酸回收馬鈴薯蛋白，過程較為溫和，相較于傳統的無機絮凝劑，不會造成重金屬二次污染，具有環保和經濟的雙重效果[15-16]，在水處理方面具有廣闊的發展前景[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯，內蒙古蒙森農業科技股份有限公司；聚谷氨酸(純度≥90%)，天津慧智百川生物技術有限公司；CaCl2、K2SO4、CuSO4均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設備

752紫外可見分光光度計,天津市拓普儀器有限公司；TGL-16C臺式高速離心機，湖南星科科學儀器有限公司；FE20數顯pH計，北京匯中順成科技有限責任公司；SKY-2102搖床，蘇坤實業有限公司；WDP-9062電熱恒溫培養箱,上海安亭科學儀器有限公司；GZX-9030MBE數顯鼓風干燥箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠；K9840自動凱氏定氮儀，山東海能科學儀器有限公司；JSM-IT300LV掃描電子顯微鏡，無錫東立智能技術有限公司；IS50傅里葉紅外光譜分析儀，美國尼高力儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 聚谷氨酸絮凝馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質

馬鈴薯淀粉廢水制備：將馬鈴薯洗凈、切塊，用破碎機破碎，得到渣水混合物；用80目濾網進行過濾，使渣水分離，自然沉降 24 h，取上清液，即得到馬鈴薯淀粉廢水。準確量取100 mL馬鈴薯淀粉廢水于250 mL燒杯中，加入聚谷氨酸以及助凝劑CaCl2[18]，并調節pH值，以200 r/min的速度用磁力攪拌器攪拌，放入水浴鍋中靜置一段時間，于5 000 r/min離心10 min，離心沉淀所得即為回收的馬鈴薯蛋白質。

1.2.2 蛋白質去除率的測定

馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，采用凱氏定氮法。按公式(1)計算馬鈴薯蛋白去除率：

(1)

式中：m1，回收后的馬鈴薯蛋白，g；m2，馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質含量，g；m3，聚谷氨酸中蛋白質含量，g。

1.2.3 單因素試驗

探究聚谷氨酸添加量、pH、助凝劑添加量、溫度、絮凝時間對馬鈴薯蛋白含量的影響。

1.2.4 響應面優化試驗

依據前期試驗結果，確定了聚谷氨酸添加量、pH值、絮凝溫度為實驗因素。以馬鈴薯粗蛋白去除率為響應值，進行中心組合設計實驗，各因素水平及編碼值如表1所示。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 馬鈴薯蛋白的紅外光譜分析

將干燥的馬鈴薯蛋白進行紅外測試，掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數為16，采用KBr壓片法：取1 mg完全干燥的馬鈴薯蛋白粉末，并以質量比1∶150與干燥的光譜級KBr粉末一同均勻混合并在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中研磨，完全研細直至粉末平均粒徑達到2 μm。再將研好的粉末均勻倒入壓模器中，經抽真空處理后，加壓至20 MPa，即得到馬鈴薯蛋白的半透明薄膜。最后將薄片置于樣品架，進行紅外光譜測定。

1.2.6 聚谷氨酸絮體掃描電鏡分析

加入聚谷氨酸以及助凝劑絮凝出馬鈴薯蛋白，烘干后制成薄膜，樣品表面鍍金，用掃描電鏡觀察形態變化。

1.2.7 廢水檢測指標及方法

pH采用數顯pH計；化學需氧量的測定采用COD快速測定儀；氨氮參照 CJ/T 75—1999 納氏試劑比色法測定?？偭讌⒄誈B 11893—1989鉬酸銨分光光度計法進行測定。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次，使用Design-expert V8.0.6進行響應面設計及統計分析，采用Origin 9.0進行數據處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 聚谷氨酸添加量對馬鈴薯蛋白含量的影響

隨著聚谷氨酸添加量的增加，由圖1可知，蛋白含量基本呈上升趨勢。當聚谷氨酸添加量為1 g/L時粗蛋白含量最高，此時蛋白回收率達到67.46%。隨著聚谷氨酸添加量的增大，蛋白含量不再增加，呈下降趨勢。絮凝劑添加過量時，會使已經形成的絮體重新變成穩定的膠體。因此，選擇聚谷氨酸添加量為1 g/L。

圖1 聚谷氨酸添加量對馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.1 Effect of polyglutamic acid on flocculation of potato protein content

2.2 pH對馬鈴薯蛋白含量的影響

由于馬鈴薯廢水偏酸性，故絮凝pH值在酸性區間選擇。隨著pH值的降低，蛋白質含量呈上升趨勢，在pH值為3.5時，蛋白質含量最高為68.19%；隨著pH值的繼續下降，蛋白含量也相繼下降，這可能與馬鈴薯貯藏蛋白的等電點有關， 等電點在pH為3.5附近，蛋白質分子顆粒不存在同電的相互排斥作用，極易發生碰撞，蛋白質最容易發生聚沉[19]。同時低pH值有利于原水中帶負電的膠粒發生電性中和及壓縮雙電層作用，從而減少了膠粒間斥力[20]。因此選擇pH值在3.5為回收馬鈴薯蛋白的最佳pH值。

圖2 pH對馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.2 Effect of pH on flocculation of potato protein content

2.3 助凝劑添加量對馬鈴薯蛋白含量的影響

添加助凝劑不僅有助于降低混凝劑用量還有助于降低混凝過程對流體力學條件的依賴性,提高混凝的穩定性。本實驗選取CaCl2為助凝劑添加到絮凝過程中。由圖2可知，隨著助凝劑添加量的增加，蛋白質含量最高可達到66.57%。之后隨著絮凝劑含量的增加，蛋白含量上升趨勢不明顯。不加入助凝劑時，蛋白回收率相差較大。因此選擇助凝劑的添加量為質量分數1%。

圖3 助凝劑添加量對馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.3 Effect of coagulant aid on flocculation of potato protein content

2.4 溫度對馬鈴薯蛋白含量的影響

隨著溫度的增加，蛋白質含量先升高后降低。在溫度為40 ℃時，蛋白含量最高為67.42%。同時，絮凝劑的擴散速度和顆粒的碰撞速度也隨著溫度的升高而增加；而當溫度高于50 ℃時， 蛋白質的去除率隨著溫度的升高而降低。這是因為吸附過程是放熱過程，溫度過高不利于絮凝發生[21]。并且隨著溫度的升高，蛋白會逐漸變性，不僅顏色會發生改變，而且會降低馬鈴薯蛋白的品質，故選擇較溫和的40 ℃為馬鈴薯蛋白含量的最佳絮凝溫度。

圖4 溫度對馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.4 Effect of temperature on flocculation of potato protein content

2.5 絮凝時間對馬鈴薯蛋白含量的影響

隨著絮凝時間的增加，蛋白含量呈現先升高最終趨于平緩的趨勢。絮凝體系的形成需要一定的時間，隨著時間的增加，蛋白沉淀逐漸增加，在靜置40 min時，蛋白質含量為68.16%。馬鈴薯蛋白質處于等電點時，呈絮狀沉淀物，此現象稱為蛋白質的結絮作用。結絮作用所形成的絮狀物不穩定，隨著時間的延長，可以再溶于溶液中[22]。因此絮凝效果在35 min時達到峰值，隨著絮凝時間的進一步延長，蛋白含量基本保持不變，結絮后的蛋白質可能重新溶于水中導致回收率降低。由圖5可知，隨著時間的變化，絮凝時間和其他因素相比，回收率的波動較小，因此優化時，不考慮絮凝時間這一因素。

圖5 絮凝時間對馬鈴薯蛋白含量的影響Fig.5 Effect of flocculation time on flocculation of potato protein content

2.6 響應面優化實驗結果

利用Design-Expert8.5軟件對其進行試驗設計，本實驗一共需做17組試驗，每組試驗做3個平行實驗，取平均值。

表2 多元回歸方程的方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted response surface mode

2.7 驗證實驗

為了驗證優化后的發酵培養基是否達到預期效果，按照實驗模型的預測條件進行重復性試驗，重復3次，測得結果取算數平均值，得到馬鈴薯蛋白去除率為68.43%，與預測值較為接近，證明此模型參數可靠，有參考價值。使用聚谷氨酸絮凝的馬鈴薯蛋白為灰白色，有利于蛋白的后續應用。在蛋白回收率方面，與酸熱法[23]、堿提酸沉法[24]、無機絮凝劑法[25]等傳統方法相比，本研究方法回收馬鈴薯蛋白質較為理想。

2.8 馬鈴薯蛋白的紅外光譜掃描

2.8.1 聚谷氨酸的絮凝機理

聚谷氨酸在1 240 cm-1處并沒有吸收峰，而聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白樣品中都在1 240 cm-1有吸收峰，此峰是羧基中C—O的伸縮振動所引起的。進一步說明了聚谷氨酸在絮凝過程中游離的羧基減少?？赡苁怯捎诰酃劝彼嶂械陌被?、羧基分別與馬鈴薯蛋白中的氨基、羧基形成了新的酰胺鍵，發生了交聯反應。

a-加入助凝劑CaCl2聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白樣品；b-未加入助凝劑CaCl2聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白樣品；c-絮凝劑聚谷氨酸純品圖6 聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白的紅外光譜圖Fig.6 IR spectrum for flocculation of potato protein with polyglutamic acid

2.8.2 助凝劑CaCl2在聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白過程中的作用

(1)加入助凝劑CaCl2后，3 400 cm-1處的吸收峰明顯增強，這個峰歸屬于締合的氫鍵(仲氨基和羧基之間)的O—H伸縮振動。當加入Ca2+后，增強了氨基與羧基之間的電離作用力，使締合的氫鍵增強，由于氫鍵的作用力增強，聚谷氨酸氫鍵和Ca2+之間的靜電作用力也隨之增強。

(3)加入助凝劑CaCl2后，1 315 cm-1的吸收峰發生藍移至1 330 cm-1。1 330 cm-1為脂肪族仲胺中C—N的伸縮振動峰。加入Ca2+后，仲胺中C—N上的電子云更集中，C—N鍵增強，增強了聚谷氨酸的負電性或帶電能力，所以聚谷氨酸的靜電力提升。

上述幾個化學鍵的變化表明，CaCl2的加入，提升了聚谷氨酸的靜電能力，使得聚谷氨酸的絮凝作用增強。掃描電鏡的結果顯示，聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白過程中加入助凝劑CaCl2，主要由于橋聯作用提高了絮凝效率。

2.9 掃描電子顯微鏡分析

γ-PGA分子結構中有大量的游離羧基，具有-COO-反應活性基團，對陽離子具有一定的絡合能力。帶正電的離子會與γ-PGA的游離羧基結合從而改變γ-PGA的帶電性，進一步改變γ-PGA分子間的作用力，因此加入Ca2+， γ-PGA便凝聚成絮團狀集合體而發生聚沉[26]。

由圖7-a和圖7-b可以看出，由于在絮凝過程中，聚谷氨酸與馬鈴薯淀粉廢水中懸浮物顆粒在吸附架橋和電中和壓縮雙電層的機理作用下[26]，形成的絮體呈立體網狀結構；同時由于生物大分子的振動收縮，在絮體沉降過程中，不斷將分散在馬鈴薯淀粉廢水中蛋白顆粒網捕和卷入絮體中[26]，而與絮體一同沉淀下來。絮凝過程中的絮體電鏡掃描圖圖7-c以及圖7-d反映了這一機理,即網捕卷掃機理。紅外圖譜的結論與掃描電鏡的結論吻合。

圖7 聚谷氨酸絮體掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope of flocs of polyglutamic acid

2.10 馬鈴薯廢水處理前后相關指標變化

使用聚谷氨酸去除馬鈴薯淀粉廢水中的馬鈴薯蛋白后，馬鈴薯蛋白含量為65%，馬鈴薯淀粉廢水的指標變化如表3所示。使用聚谷氨酸處理后的馬鈴薯淀粉廢水，氨氮、總磷以及COD以及懸浮物(suspended substance, SS)值都降低。一方面，從工業廢水處理的角度看，氨氮、總磷以及COD的降低有利于馬鈴薯廢水的后續處理，可以考慮使用生物處理法進一步處理回收蛋白后的馬鈴薯淀粉廢水，實現廢水的資源化利用。另一方面，從肥料應用的方面看，利用其中的氮元素以及磷元素等，以馬鈴薯廢水作為水溶性肥原料進行下一步研究。

表3 馬鈴薯淀粉廢水的指標變化Table 3 Index changes of potato starch wastewater

3 結論

本研究利用新型微生物絮凝劑聚谷氨酸去除馬鈴薯蛋白，通過單因素試驗以及響應面優化試驗，得出：聚谷氨酸添加量0.93 g/L、初始pH值為3.23，絮凝溫度40 ℃、靜置時間為40 min，此條件下馬鈴薯蛋白去除率為68.43%。通過傅里葉紅外光譜分析表明，聚谷氨酸絮凝馬鈴薯蛋白可能是聚谷氨酸中的氨基、羧基分別與馬鈴薯蛋白中的氨基、羧基形成了新的酰胺鍵，發生了交聯反應。通過掃描電子顯微鏡分析表明，馬鈴薯蛋白通過網捕卷掃機理進入聚谷氨酸以及助凝劑形成的立體網狀結構。測定回收蛋白前后馬鈴薯淀粉廢水的相關指標值，氨氮去除率為40.62%、總磷去除率為42.66%、COD去除率為34.80%。此方法提取出的馬鈴薯蛋白，相比于無機絮凝劑，不會造成金屬元素的超標，并且不會對環境造成二次污染，可以循環利用，如蛋白肥料的應用。本研究為馬鈴薯淀粉廢水的處理提供了新的思路與方法，有利于實現馬鈴薯廢水的資源化利用。在水處理方面應用前景廣闊，具有可行性。