醬油發酵過程中一株4-乙基愈創木酚轉化菌的篩選及鑒定

郭明威，耿予歡

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510641)

醬油是我國傳統的發酵調味品，與人們的生活息息相關。醬油發酵是多種微生物共同作用的過程，經過微生物及其酶系的長期作用，賦予了醬油良好的風味[1]。4-乙基愈創木酚(4-ethyl guaiacol, 4-EG)，分子式為C9H12O2，呈發酵香氣，微帶酚的氣息，通常被描述為一種煙熏味和丁香味的物質，存在于日本醬油和中國傳統高鹽稀態醬油，其香氣很受消費者歡迎[2]。4-EG風味閾值極低，其含量相差0.5 mg/L就很容易被感官識別，有文獻認為，1～2 mg/L的4-EG便可明顯改善醬油的風味品質[3]。因此，4-EG的含量與醬油的品質存在較為密切的關系。

4-EG可以通過化學合成，也可以從天然植物中提取，或者通過生物轉化法制備，工業化生產主要是通過化學合成途徑進行的[4]。由于人造食品的潛在危害，人們對天然食品的需求持續增長，但是從天然植物中提取4-EG的量非常有限，不能滿足日益增長的消費需求[5-6]。而生物催化轉化法具有反應條件溫和、底物專一性好、工藝環境友好等優點，近年來發展迅速[7-8]。

近些年，有關生物催化轉化方式的研究較多。董永勝等[9]發明了一種利用環狀芽孢桿菌和酒香酵母菌株發酵產生4-EG的方法。王少磊等[10]從濃香型大曲中篩選到1株產4-EG的菌株。肖澎等[4, 11]探究了阿魏酸(ferulic acid，FA)轉化為揮發性酚的途徑，由FA轉化生成4-EG的途徑分為2步：首先FA在脫羧酶的作用下可轉化為4-乙烯基愈創木酚(4-vinyl guaiacol，4-VG)，隨后4-VG通過還原酶的作用轉化為4-EG。SUN等[12]研究了以米糠為原料制備FA粗提液，并利用地衣芽孢桿菌發酵進一步產生4-VG的方法。然而在醬油釀造過程中，利用生物轉化產生4-EG的研究目前報道較少，本研究主要對高鹽稀態醬油釀造過程中能夠產生4-EG的菌株進行篩選、鑒定，并探討菌株的生長特性，以期為提高傳統醬油產品中4-EG的含量奠定相關研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

樣品：菌種篩選原料由廣東某食品有限公司提供；曲料和醬醪取自制曲車間和發酵缸。

試劑：FA、4-EG，麥克林生化科技有限公司；4-VG，上海阿拉丁試劑有限公司；細菌DNA試劑盒，廣東環凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純，廣州叢源試劑有限公司。

儀器設備：LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋、DNP-9082生化恒溫培養箱，上海博迅醫療生物儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，深圳市永盛旺實業有限公司；THZ-82恒溫振蕩培養箱，常州恩培儀器有限公司；KH20A臺式高速離心機，上海析域儀器設備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；U3000高效液相色譜儀，賽默飛科技有限公司；Agilent 7000C三重串聯四級桿氣質聯用儀，安捷倫科技有限公司；IX73熒光倒置顯微鏡，奧林巴斯有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制

LB液體培養基：NaCl 0.5 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖0.1 g，蛋白胨 1 g，溶于100 mL去離子水，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養基：同LB液體培養基配制方法，再加入2%(質量分數)瓊脂粉。

發酵培養基：FA 0.1 g，酵母膏1 g，KH2PO40.09 g，Na2HPO41 g，MgSO40.02 g，CaCl20.01 g，溶于100 mL蒸餾水，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌株的分離

分別稱取10 g發酵醬醪、發酵成曲，在無菌條件下研磨成粉末加入到250 mL三角瓶中，同時加少數玻璃珠和90 mL生理鹽水，在30 ℃，160 r/min條件下振蕩20 min制成10-1菌種懸浮液，再用無菌生理鹽水將懸液梯度稀釋至10-4～10-7。取0.1 mL濃度為10-4～10-7的菌種懸液涂布于LB平板上30 ℃倒置培養24～48 h[13]。

根據菌落的形態特征等挑取單菌落在LB平板上劃線，30 ℃培養24 h，得到產4-EG菌株的單克隆。將純化的菌株接種于LB培養基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養24 h，置于甘油-20 ℃保藏[14]。

1.2.3 4-EG產生菌株的篩選

從菌株斜面上挑取菌落接至LB液體培養基中，于30 ℃，160 r/min搖床培養24 h制成瓶種。將種子液以5%的接種量(體積分數)接種至發酵培養基，30 ℃、160 r/min振蕩培養6 d[15]。

移取發酵液10 mL，加同等體積二氯甲烷，混勻靜置5 min，8 000 r/min離心15 min，轉移至分液漏斗，待分層后取下層清液，以上操作重復3次，合并萃取液，加5 g無水硫酸鈉冷凍過夜除去水分，用韋氏蒸餾柱濃縮至5 mL(60 ℃保持微沸)，氮氣吹掃濃縮至2 mL，過0.22 μm有機濾膜，用GC-MS/選擇離子監測(selective ion monitoring, SIM)法進行檢測分析。根據GC-MS檢測結果選取目標菌株進行下一步分析鑒定[16]。

色譜條件：HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；恒流：1.0 mL/min；分流比15∶1；進樣量1 μL；進樣口溫度250 ℃。升溫程序：初溫50 ℃，以8 ℃/min升溫至100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至170 ℃保持3 min，以15 ℃/min升溫到235 ℃，保持4 min，總分析時間29.58 min[17]。

質譜條件：電子電離源，能量70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度240 ℃。定性采用全掃描模式，質量掃描范圍m/z50～500；定量采用SIM，4-EG的特征離子為：m/z137/152/122[18]。

1.2.4 目標菌株發酵過程各種物質含量的測定

將初篩所得目標菌株活化培養成種子液，接種至發酵培養基，于30 ℃、160 r/min振蕩培養12 d，每2 d 取10 mL樣品過濾離心后保存至4 ℃冰箱，發酵結束用HPLC檢測樣品中FA、4-VG及4-EG的相對含量，探究菌株發酵過程中3種物質的含量變化[19]。

HPLC條件：Waters Atlantis?T3反相C18色譜柱 (5 μm×4.6 mm×250 mm)，流動相：A為甲醇，B為1%甲酸水；洗脫程序：0～15 min，100%～48% B；15～20 min，48% B；20～30 min，48%～30% B；30～35 min，30% B；流速為1 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長為0～18 min，320 nm；18～35 min，280 nm。

制定標準曲線：取標準品FA、4-VG、4-EG，溶于甲醇配制質量濃度為100 mg/L的混合標準溶液，依次稀釋為：20、40、60、80、100 mg/L。用HPLC測定，甲醇為空白對照，以標準溶液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標制定標準曲線，建立線性方程[20]。

1.2.5 菌株鑒定

1.2.5.1 形態特征觀察

經過發酵實驗篩選的目標菌株，將其菌懸液梯度稀釋后涂布于LB平板培養基，置于35 ℃恒溫箱培養24 h，觀察菌體在固體平板上的形狀、顏色、黏稠度、透明度等特征，提取單菌落進行革蘭氏染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察菌體的顯微形態[21]。

1.2.5.2 菌株生理生化鑒定

菌株的生理生化實驗參考第九版《伯杰氏細菌鑒定手冊》及東秀珠所著《常見細菌系統鑒定手冊》，主要包括蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖等糖氧化發酵實驗，鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸等氨基酸脫羧酶實驗，過氧化氫酶、脲酶、檸檬酸鹽利用、甲基紅實驗、V-P實驗、吲哚實驗、淀粉水解、明膠水解、酪素水解等[12]。

1.2.5.3 菌株分子生物學鑒定

用試劑盒提取菌株基因組，采用16S rDNA通用引物，以目標菌株DNA為模板進行PCR擴增。取5 μL PCR擴增產物用于瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測結果正確的樣品送往廣州艾基生物技術有限公司測定16S rDNA序列。

測序結果拼接后導入NCBI數據庫進行同源性BLAST比對，然后下載比對相似度在99.8%以上的前10個菌種的DNA序列，并利用MEGA-X構建系統發育樹，并進行1 000次bootstraps檢驗計算支持率[10]。

1.2.6 目標菌株生物學特性研究

1.2.6.1 形態特征觀察

將目標菌株等量接種到裝有10 mL培養基的試管中，分別在不同溫度，轉速為160 r/min的搖床培養24 h，溫度分別為25、28、30、32、35、37、40、42 ℃，空白對照為LB液體培養基，用紫外分光光度計測定600 nm處OD值[13]。

1.2.6.2 生長曲線

將目標菌株等量接種到裝有10 mL培養基的試管中，置于30 ℃、160 r/min的搖床振蕩培養，分別培養2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h，將標有相應時間的試管取出，立即放4 ℃冰箱保存，空白對照為LB液體培養基，用紫外分光光度計測定600 nm處OD值。

1.2.6.3 耐鹽性

將目標菌株等量接種到不同NaCl濃度的LB液體培養基，在30 ℃、160 r/min振蕩培養24 h，NaCl的質量分數分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%，空白對照為LB液體培養基，用紫外分光光度計測定600 nm處OD值[13]。

1.2.7 統計分析

每個實驗均設置3次平行，實驗數據使用 Microsoft Office Excel 2010處理，實驗結果用平均值±標準偏差的形式表示。

2 結果與討論

2.1 4-EG產生菌株篩選

將菌種原料進行多次稀釋涂布培養和劃線分離，根據平板上菌落特征初步篩選分離獲得10種菌株，根據分離時間順序給菌株進行編號。將分離到的10株單菌接種到發酵培養基中，32 ℃、160 r/min振蕩培養6 d，以4-EG含量為100 mg/L的標準溶液為對照，用GC-MS/SIM法檢測發酵樣品中的4-EG的含量，檢測結果如表1所示。

表1 菌株篩選結果Table 1 Results of strain screening

由表1可知，菌株G02、G03、G08均可利用發酵培養基中的FA產生4-EG，其中菌株G08的產4-EG能力最強，該菌株發酵產物的4-EG含量可達28.49 mg/L，因此選取該菌株做下一步分析鑒定。

2.2 菌株G08發酵過程各種物質含量測定

2.2.1 標準曲線制作及線性關系考察

標準混合樣品的液相色譜圖如圖1所示

1-FA(17.4 min)；2-4-VG(24.6 min)；3-4-EG(27.2 min)圖1 標準混合樣品液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of mixed standards

以標準溶液中的物質質量濃度(mg/L)和HPLC標準色譜圖峰面積分別為橫縱坐標制定標準曲線。FA的回歸方程：y=0.952 8x-2.922 1，R2=0.996 6；4-VG的回歸方程：y=0.471 8x-0.236 8，R2=0.998 7；4-EG的回歸方程：y=0.250 2x-0.463 5，R2=0.998 6。

2.2.2 菌株G08發酵過程物質含量變化

將菌株G08活化培養成種子液，接入發酵培養基中，30 ℃、160 r/min恒溫發酵12 d，每2 d取10 mL樣品過濾離心后保存至4 ℃冰箱，發酵結束后用HPLC檢測不同發酵時段的樣品中FA、4-VG及4-EG的相對含量，結果如圖2所示。

在菌株G08發酵前期，FA的含量在迅速降低，而4-VG的含量在不斷升高，由此表明這一階段的生物轉化反應以FA脫羧生成4-VG為主。從第4天開始FA的含量基本穩定在190 mg/L，與此同時4-VG的含量在第4天達到最高為178 mg/L，隨后開始逐漸降低，到第8天穩定在65 mg/L，而4-EG的含量則緩慢升高，且由第8天開始含量增速明顯加快，到第12天達到最高為62 mg/L，由此可估算4-EG的摩爾轉化率為7.92%。

圖2 G08發酵過程中物質含量變化Fig.2 Changes of substance content during G08 fermentation

2.3 菌株G08的鑒定

2.3.1 形態特征鑒定

菌株G08經生理鹽水稀釋后涂布在LB平板上，35 ℃培養24 h，觀察菌落形態，菌落幼期為乳白色，成熟期為淡黃色，不透明，形狀規則，中央隆起，表面黏稠，邊緣整齊(圖3-a)；在液體培養基中菌體成團，菌液渾濁，可產生菌膜；在顯微鏡下觀察顯微形態，菌體為不規則短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，產芽孢(圖3-b)。

a-菌落形態；b-顯微形態圖3 菌株G08的菌落形態和顯微形態Fig.3 Colony morphology and micromorphology of strain G08

2.3.2 菌株生理生化鑒定

菌株G08的生理生化特性試驗結果如表2所示。該菌株可氧化發酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖，發酵過程中產酸但不產氣，不能夠利用木糖。依據《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊(第九版)》的現有菌株特性進行比對，發現菌株G08的生理生化特性與芽孢桿菌屬十分相似，可以初步判斷為芽孢桿菌，還需通過分子生物學鑒定進一步驗證。

表2菌株G08的生理生化特性Table 2 Biochemical and physiological characters of strain G08

2.3.3 菌株的分子生物學鑒定

以菌株G08基因組為模板進行PCR擴增，然后進行電泳試驗，電泳檢測結果如圖4所示，擴增片段分子質量大約在1 200～1 500 bp，條帶清晰明亮且不存在非特異性擴增，表示16S rDNA 擴增成功。將擴增產物回收純化后進行測序，確定該片段的實際長度為1 368 bp。

圖4 菌株G08的16S rDNA凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis pattern of PCR amplified product of 16S rDNA from strain G08

將測序結果提交至NCBI 數據庫用BLAST程序進行同源性比對，比對結果顯示菌株G08與芽孢桿菌屬的幾個菌種的同源性均達到99.8%，可判定該菌株屬于芽孢桿菌屬。經多序列同源性分析，得到10個同源性大于99.8%的菌株，用MEGA-X軟件構建系統發育樹，獲得菌株G08的系統發育地位，系統進化樹如圖5所示。結果表明菌株G08與Bacillussubtilis屬于同一分支，綜合該菌株的形態特征和生理生化特性，判斷該菌株是芽孢桿菌屬中的一個種，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，命名為BacillussubtilisG08。

圖5 菌株G08基于16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of strain G08

2.4 菌株G08的生物學特性

2.4.1 最適生長溫度

由圖6可知，菌株G08的最適生長溫度為35 ℃，低于35 ℃時，隨溫度的升高，OD600值緩慢遞增；當高于35 ℃時，隨溫度的升高，OD600值逐漸遞減。

圖6 菌株G08的最適生長溫度Fig.6 The optimum growing temperature for strain G08

2.4.2 生長曲線

由圖7可知，在培養初期(0～10 h)菌株G08生長較為緩慢，為生長遲緩期；培養中期(10～16 h)生長速度明顯加快，為對數增殖期；16 h后生長速度開始減緩，到18 h進入穩定期，OD600值基本不發生明顯改變。

圖7 菌株G08的生長曲線Fig.7 The growth curve of strain G08

2.4.3 耐鹽性

由圖8 可知，當NaCl質量分數低于5%時，隨著NaCl含量的升高，菌株G08的OD600值呈遞增趨勢，由此說明適量的NaCl有助于該菌株生長增殖；而NaCl質量分數高于5%時，菌株OD600值明顯減??；NaCl質量分數在7%～9%時，菌株還能夠正常生長；當NaCl質量分數高于9%時，菌株的生長明顯受到抑制；NaCl質量分數高于11%時，菌株基本難以生長，由此可判斷菌株G08對NaCl的耐受性為9%。

圖8 菌株G08的耐鹽性Fig.8 The salt tolerance of strain G08

3 結論

本研究以FA為主要原料的培養基，以菌株發酵產物中4-EG的含量為參考標準，從傳統中式醬油的醬醪、成曲中分離篩選到1株能夠將FA轉化4-EG的菌株G08，并探究了其轉化過程中FA、4-VG及4-EG的含量變化。采用形態觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析等方法判斷該菌株屬于枯草芽孢桿菌。該菌株在轉化FA成為4-EG的能力上優于其他菌株，4-EG的摩爾轉化率可達到7.92%?，F已有文獻報道一些耐鹽酵母和芽孢桿菌有類似的轉化能力，但如何將這類菌株與米曲霉、黑曲霉等醬油生產所用的常規菌種綜合利用，有效開發麩皮、米糠、甜菜粕等農副產品中的阿魏酸，通過多菌種不同階段連續發酵的方式提高醬油中4-EG的含量，需要結合生產實踐進一步研究。