一株分解海參體壁蛋白的耐鹽菌株的篩選及發酵條件優化

韓爽，劉奎，張健，井月欣，王藝欣，劉芳，王共明，劉海超，鐘靜詩

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(山東省海洋資源與環境研究院，山東 煙臺，264006)

海參體壁是海參主要食(藥)用部位，其蛋白含量非常豐富。研究發現，海參體壁蛋白中約70%為膠原蛋白[1]，由于其包裹作用，海參中營養物質難以被消化吸收，降解后的海參多肽易吸收且具有抗氧化[2]、抗疲勞[3]、抗菌、抗腫瘤[4]等活性。同時，隨著海參蛋白的降解，與膠原纖維連接的其他營養成分得以釋放。以海參主要功能成分之一——巖藻糖基化硫酸軟骨素為例，沿膠原纖維以共價O-糖苷鍵與之結合，呈環狀周期性分布[5]，降解膠原纖維后有助于其釋放。

生物酶解法及微生物發酵法具有作用條件溫和、無有毒物質殘留及操作易控制等優點[6]，是目前較為普遍采用的蛋白降解方法[7]。由酶解及微生物發酵進行蛋白降解可以提高其生物活性及消化率，同時會改善感官品質[6]，提升產品鮮味[8]。但目前用于海參蛋白降解的酶及微生物多為普通食品商業酶[9-10]及菌株，缺乏針對性，易造成水解不完全等問題，故多采用復配酶[11]及酶解發酵聯用[12]的方法以提高海參蛋白降解水平。由于鮮海參難以儲存，為延長其儲存期，90%左右的海參都經過鹽漬處理[13]，但目前通用型商業酶及微生物耐鹽性低，因此降解前需將海參進行脫鹽處理。而相關研究發現，海參在脫鹽過程中會造成蛋白、多糖及特征性風味物質的損失[14]，且會破壞其組織形態[13]。通過篩選可直接分解海參蛋白的耐鹽菌株可為發酵法提供備選微生物，進而促進相關蛋白酶資源的開發。

為篩選得到可在高鹽環境下直接進行海參蛋白分解的微生物菌株，本實驗采用以海參蛋白作為唯一氮源的馬丁氏培養基(高鹽)， 篩選得到3株可直接降解海參蛋白的海水源菌株。通過對3株菌發酵海參蛋白能力的比較，選定降解能力最強的1株菌進行發酵條件優化，并與4株常見商業發酵菌對比，記錄72 h發酵過程中發酵液的菌體濃度、pH以及水溶性蛋白含量的動態變化。通過研究，獲得了可在高鹽環境下進行海參蛋白直接分解的微生物菌株及其最佳發酵條件，為未來相關商業菌株及酶的開發提供基礎數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 主要材料

鹽漬仿刺參，煙臺市開發區八角海鮮市場；鏈霉素(生化試劑)，美國Sigma-Aldrich；Lowry蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep 柱式 DNA 膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq Plus DNA聚合酶、瓊脂糖B、4S Red Plus核酸染色劑(10 000×水溶液)，BBI生命科學有限公司；API Staph，生物梅里埃法國股份有限公司；葡萄球菌乳膠凝集試劑盒，賽默飛世爾科技公司。

1.1.2 主要設備

XHF-DY 高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；MQL-61R立式全溫振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；Kjeltec8400凱氏定氮儀，丹麥Foss公司；SevenCompact pH計、ME204E 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BSP-100F生化培養箱，沙鷹科學儀器(上海)有限公司；5430R離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海參勻漿液制備

取鹽漬仿刺參200 g，置于1 L燒杯中，加純水800 mL沒過海參，在4 ℃冰箱中浸泡12 h后取出，去除口環后清洗并稱質量，記為m1，加純水1 L并煮40 min。將煮制完成的海參及煮液一起倒入1 L燒杯中并續水至800 mL，放4 ℃冰箱浸泡6 h后，加純水1 L，復煮40 min。然后以m1∶m[純水(含蒸煮液)]=1∶5的比例向含海參的煮液中補充加入純水，剪碎海參后用高速分散器勻漿，制得海參勻漿液。

1.2.2 培養基設計

1.2.2.1 固體馬丁氏培養基(高鹽)的制備

參考文獻[15]中固體馬丁氏培養基配方并加以改進。葡萄糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1/3 000虎紅鈉鹽溶液100 mL，海參勻漿液500 mL，海水300 mL，瓊脂粉27 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min，用前加入0.03%鏈霉素稀釋液100 mL，采用SC/T 3011—2001《水產品中鹽分的測定》中的方法測定培養基鹽濃度。

1.2.2.2 液體馬丁氏培養基(高鹽)的制備

參考1.2.2.1中固體馬丁氏培養基的制備，去除瓊脂粉的添加。

1.2.3 菌株的篩選純化

將未稀釋海水和稀釋至10-2和10-4的海水分別取100 μL涂布于固體馬丁氏培養基(高鹽)中。將培養后長出的單個菌落多次劃線純化保存備用。

1.2.4 純化菌株分解海參蛋白效果比較

1.2.4.1 種子液及發酵液的制備

分別從上述篩菌固體培養基中挑取1環純化菌株，接入盛有3 mL種子培養基的試管中，28 ℃、200 r/min搖床振蕩培養制成種子液。當OD600=1時，將上述種子液轉入搖瓶中(250 mL三角瓶中裝液體馬丁氏培養基100 mL)，在28 ℃、200 r/min搖床振蕩培養72 h[16]即得發酵液。

1.2.4.2 液態培養基及發酵液中水溶性蛋白含量的測定

參照GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》方法中凱氏定氮法，將液態培養基及發酵液7 800 r/min離心10 min后，取上清液進行蛋白含量的測定。

1.2.5 菌株的鑒定

1.2.5.1 菌株形態學及生理生化特征鑒定

將純化的菌株接種于固體馬丁氏培養基上，26 ℃倒置培養24 h，觀察菌落形態并進行革蘭氏染色，于油鏡下觀察菌體形態特征，再挑取新菌落處理后進行掃描電鏡觀察。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[17]并利用試劑盒分析菌株的生理生化特征。

1.2.5.2 菌株分類的分子生物學鑒定

使用Ezup 柱式基因組DNA抽提試劑盒提取分離菌株基因組DNA。以提取的細菌DNA為模板, 以引物27F/1492R進行PCR擴增，PCR擴增條件：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，90 s；72 ℃，8 min；30個循環。取3 μL PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠凝膠電泳，將PCR產物進行16S rDNA測序，將所得特定序列在NCBI上通過BLAST程序進行菌株同源性對比[18]，最后用MEGA X 10.0.2軟件構建系統發育樹。

1.2.5.3 菌株致病性鑒定

利用葡萄球菌乳凝膠試劑盒對SW03進行常見致病性的檢驗。在檢測板上加測定試劑及菌株SW03，若2 min 內出現凝集，表明測試菌落為金黃色葡萄球菌或其他具有凝固酶或A蛋白的葡萄球菌。

1.2.6 SW03最優發酵工藝的確定

1.2.6.1 單因素試驗

通過預試驗確定發酵溫度、培養基初始pH及接種量3個單因素的水平分別為：發酵溫度為24、26、28、30、32 ℃；培養基初始pH為5、6、7、8、9；接種量為1%、3%、5%、7%、9%，其余條件與1.2.4.1相同，每個水平重復3次，結果取平均值。發酵液7 800 r/min離心10 min后取上清液，利用Lowry蛋白濃度測定試劑盒進行水溶性蛋白含量測定。

1.2.6.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以水溶性蛋白含量為響應值，采用Box-Behnken設計3因素3水平試驗[19]，因素編碼和水平如表1所示。

表1 Box-Behnken設計因素及水平表Table 1 Experimental factors and levels of Box-Behnken design

1.2.7 SW03及4株商業菌株發酵過程中的動態變化

1.2.7.1 SW03及4株商業菌株生長曲線的測定

SW03及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides) OD600 nm=1的菌液6 mL接種于200 mL馬丁氏液體培養基中, 在各菌株最適生長條件下培養0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h， 每個時間段重復 3次。以空白馬丁氏液體培養基為對照，測定不同菌株各時間段OD600 nm值。以菌株培養時間為橫坐標，以OD600 nm值為縱坐標繪制各菌株生長曲線。

1.2.7.2 發酵過程中pH及水溶性蛋白含量的變化

參照1.2.7.1中培養及接種方法，培養0、1、2、3、4、5、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h，每個時間段重復3次。以空白馬丁氏液體培養基為對照，測定不同菌株各時間段pH及水溶性蛋白含量。以菌株培養時間為橫坐標，以pH和水溶性蛋白含量為縱坐標繪制曲線。

1.2.8 數據處理

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及蛋白含量的測定

經測定，改良后的馬丁氏培養基鹽質量分數為(2.5±0.1)%。利用馬丁氏培養基，從海水中分離純化得到3株可分解海參蛋白的菌株SW01、SW02和SW03。對上述菌株所得發酵液及未發酵培養基的離心上清液中蛋白含量的測定結果如表2所示。SW03對海參蛋白的分解效果最佳，因此后續研究圍繞菌株SW03展開。

表2 未發酵培養基及發酵液中水溶性蛋白含量 單位：g/kg

2.2 菌株形態學及生理生化特征

SW03菌株為革蘭氏陽性菌，菌落橙黃色、濕潤，菌落直徑為(0.15±0.003)cm。菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，中間凸起(圖1-a)；菌體呈球狀，大小為8.5～9 μm(圖1-c)，革蘭氏陽性(圖1-b)。利用API Staph試劑盒測定的生理生化特征結果見表3。將所得結果與菌種庫進行對比后發現，無與該菌株匹配的具體種，也與常見的葡萄球菌致病菌的生理生化指標不符。致病性葡萄球菌一般菌體大小在0.5～1 μm，且利用凝膠試劑盒進行測定時會出現凝集現象[20]。SW03相對致病菌菌體更大，且在常見葡萄球菌的致病性檢測中未出現凝集現象，檢測結果呈陰性，由此初步推測，菌株SW03不具致病性。

a-菌落形態圖；b-革蘭氏染色圖；c-掃描電鏡形態圖圖1 菌株SW03的菌體及菌落形態Fig.1 Microscopic and colony morphology of SW03

表3 菌株SW03的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of SW03

2.3 菌株分子生物學鑒定

將測序所得特定序列在NCBI網站通過BLAST程序進行同源性對比并用MEGA X 10.0.2軟件構建系統發育樹結果如圖2所示。該菌株的16S rDNA序列與數據庫中葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)中的多個種的16S rDNA序列相近，同源性都大于97%，因此推斷SW03是葡萄球菌屬。但從系統發育樹上可以看出，雖然SW03與葡萄球菌屬中各種的系統發育關系很近，分支處數值卻較低，推測可能出現了變種，這也與生理生化特征的驗證結果相符。葡萄球菌多用于肉制品的發酵，是常見的發酵劑[21-22]，并因其高效分解蛋白的能力成為研究熱點，本研究利用其高效分解蛋白的能力，進行海參蛋白的降解。

圖2 基于16S rDNA序列菌株SW03的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of SW03 based on 16S rDNA sequence

2.4 單因素試驗結果

由圖3-a可知，在24～26 ℃隨溫度的上升，蛋白含量呈上升趨勢，當溫度為26 ℃時蛋白含量最高，26 ℃后隨溫度的上升開始呈現下降趨勢，故在26 ℃左右可達到較好發酵效果。由圖3-b可知，接種量為1%～3%時，蛋白含量隨接種量的增大而不斷提高，接種量為3%時含量最高，此后繼續增大接種量，蛋白含量下降。相關研究發現培養基內營養物質的過度消耗會抑制菌株產酶的能力，進而影響其發酵效果，導致蛋白含量下降[22]，故在接種量為3%左右時可達到較好發酵效果。由圖3-c可知，pH<7時, 隨著pH的增加蛋白含量不斷增加, 在pH 7時達到最高點，隨后隨著pH的上升蛋白含量開始下降。pH通過對降解底物解離程度及細胞結構和功能的影響對菌株發酵效果產生作用。pH不同，蛋白在水中的解離程度不同[24]，當pH過高或過低時會導致蛋白質變性進而影響菌株細胞膜活性[25]。因此，在初始pH 7左右進行菌株發酵可達到較好發酵效果。

a-溫度；b-接種量；c- pH圖3 溫度、接種量及pH對水溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of temperature, inoculum size and pH on the content of water-soluble protein注：誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05)

2.5 響應面優化試驗

2.5.1 Box-Benhnken結果

利用Design-Expert 8.0.6對數據進行多元二次回歸擬合，得到Y:水溶性蛋白含量(g/L)對A:發酵溫度(℃)、B:接種量(%)、C:培養基初始pH的多元回歸方程為：

Y=-4 527.529 3+234.786 8A+5.833 5B+464.345 0C-6.725 0AC+4.081 0BC-3.6623A2-5.945 8B2-21.807 0C2

回歸模型的方差分析結果見表4?；貧w方程決定系數R2=96.76%，表明96.76%的水溶性蛋白含量的變化可由此模型解釋，且實際值和預測值之間的擬合度和可信度良好。由表4可得，培養基初始pH和發酵溫度交互作用極顯著(P<0.01)，和接種量交互作用顯著(P<0.05)而發酵溫度和接種量交互作用不顯著。A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01)。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.5.2 各因素交互作用的響應面圖

對二次響應面回歸模型作出相應的響應曲面及等高線，結果如圖4所示。等高線的形狀反映交互項影響的強弱，橢圓形為交互作用顯著，圓形則相反。培養基初始pH和發酵溫度交互項對蛋白含量的影響顯著性高于其他兩組交互項。

圖4 各因素交互作用對水溶性蛋白含量影響的 響應面曲線及等高線Fig.4 Response surface curve and contour map of various factors on the content of water-soluble protein

2.5.3 驗證實驗

如回歸模型繪制的響應面所示，回歸模型最大點為A=25.68、B=2.9%、C=6.96，在此條件下理論預測蛋白含量為109.4 g/L，根據實際實驗室操作情況，得到最佳發酵條件為：26 ℃，接種量2.9%，pH6.9，實驗實際蛋白含量為108.2 g/L，與預測值接近，說明所建模型擬合良好且可靠。

2.6 菌株生長曲線測定

比濁法、菌落平板計數法和顯微鏡直接計數法是測定微生物生長狀況的常用方法，本研究采用比濁法反映細菌生長發育特征。如圖5所示，菌株SW03及植物乳桿菌延遲期為0～6 h，在6 h后進入快速繁殖的對數期，30 h后進入穩定期，72 h內未進入衰亡期。解淀粉芽孢桿菌及腸膜明串珠菌在經過0～6 h延遲期后，分別在6～12 h及6～18 h進入快速繁殖對數期?？莶菅挎邨U菌在0～6 h就進入快速繁殖的對數期，在60 h后出現衰亡的特征。SW03的快速繁殖期較長且進入穩定期后SW03具有較高的菌濃度。

圖5 各菌株72 h培養的生長曲線Fig.5 Growth curve of different strains cultured for 72 h

2.7 菌株發酵過程中pH及水溶性蛋白含量的變化

2.7.1 發酵液pH變化

如圖6所示，SW03及枯草芽孢桿菌的發酵液pH均是先下降后再上升，植物乳桿菌的發酵液pH先下降再上升后再出現下降趨勢，解淀粉芽孢桿菌出現2次pH上升下降的循環過程，腸膜明串珠菌pH一直呈下降趨勢，且72 h后發酵液pH最低。

圖6 各菌株發酵液的pH變化Fig.6 Changes of pH in the fermentation broth of different strains

2.7.2 發酵液水溶性蛋白含量變化

由圖7可知，SW03與枯草芽孢桿菌在0～1 h水溶性蛋白含量增長速度最快，分別在1～18 h和1～6 h水溶性蛋白含量增長速度減緩。植物乳桿菌及腸膜明串珠菌分別在0～3 h及0～6 h水溶性蛋白含量呈高速增長狀態，解淀粉芽孢桿菌在0～1 h的蛋白含量增長速度較緩，在1～3 h進入蛋白含量高速增長狀態。在進入水溶性蛋白含量的穩定期后SW03發酵液中水溶性蛋白含量顯著高于其他菌株，呈現出更佳的海參蛋白分解能力。4株商業菌株多進行泡菜、豆制品或肉制品的發酵，其可分解的蛋白種類及結構都與海參蛋白有所不同。同時，鮮海參因其難以貯藏及運輸的特點無法大量流通，方便貯藏的鹽漬海參是目前重要的海參制品及深加工原材料。鹽漬海參制品含鹽量高，實驗采用添加海參勻漿液的高鹽培養基，4株商業菌的耐鹽性不及從海水中篩選得到的SW03，對海參蛋白的降解效果也會受到限制。

3 結論

目前，可直接進行海參蛋白降解的耐鹽菌株有限，需開發新的高效商業菌株。經篩選、純化鑒定和菌株發酵條件優化后，從海水中分離得到了可直接分解海參蛋白的葡萄球菌屬(Staphylococcus)耐鹽菌株SW03，其最佳發酵條件為26 ℃，接種量2.9%，培養基初始pH6.9，在此條件下水溶性蛋白含量可以達到108.2 g/L。結果表明，該菌株除了具有海水源微生物共有的發酵溫度較低、耐鹽性強、發酵時間較短等特點外，還針對海參蛋白具有較好的降解能力可直接進行海參蛋白的降解。通過篩選獲得具有較好蛋白分解能力的SW03，一方面為采用微生物直接發酵法降解高鹽含量蛋白提供了新菌種選擇，同時也為下一步蛋白降解工具酶的開發提供優良微生物源。