同時降解兩種真菌毒素的食品級重組酵母培養條件優化

夏雨，吳梓鳳，胡修玉，包紅朵，何瑞，秋楊煜，程倩倩，王周平

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(中國生物發酵產業協會,北京,100833) 3(江蘇省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所,江蘇 南京,210014)

全球糧食作物和食品原料中真菌毒素污染問題嚴峻，正嚴重威脅著人類的生命健康[1]。其中，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)作為兩種主要的真菌毒素，容易污染花生、玉米及常見谷物，會造成肝癌、神經毒性、破壞生殖系統等嚴重后果[2-4]。對于真菌毒素的降解，除了常用的物理、化學方法外[5-6]，生物法被認為是一種可以溫和、高效降解這兩種真菌毒素的有效方法[7-8]。一些已經發現的降解酶能在一定程度上單獨實現對AFB1和ZEN的降解，且大多數酶都在大腸桿菌、酵母等表達系統中成功實現了重組酶的表達[9-10]。

乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)作為一種食品級酵母，其蛋白質分泌能力強、表達系統和發酵過程安全，被廣泛應用于食品、醫藥工業，也逐漸應用于真菌毒素降解領域的研究[11]。孫瑩[12]研究了3種來源的錳過氧化物酶并在乳酸克魯維酵母中實現了表達，優化后的酶PhcMnp對AFB1的降解率達到75.71%。徐榮榮[13]將ZEN水解酶ZHD101進行了突變，且在乳酸克魯維酵母中實現了突變體的分泌表達，其對飼料樣品中ZEN的降解率為74.60%。

目前，針對真菌毒素的生物法降解研究，主要集中在降解微生物和酶的篩選、酶的突變改造、重組菌的構建與表達、毒素降解機理研究和降解條件優化等[14-15]，而能降解真菌毒素的重組菌高密度發酵培養研究偏少，特別是針對食品級乳酸克魯維酵母重組菌的高密度發酵培養條件優化和工藝研究鮮見報道。而發酵工程的一個重要任務是提高菌體培養前期的細胞密度，為后期的發酵產物生產提供更多的生物量[16-17]。因此，為提高食品級重組乳酸克魯維酵母在食品和飼料行業的商業化應用價值，需要對該菌進行高密度培養條件優化研究。

本研究以本實驗室已構建的可同時降解AFB1和ZEN的食品級重組乳酸克魯維酵母GG799(pKLAC1-ZPF1)為主要研究對象，通過單因素試驗、響應面試驗、正交試驗等方法優化了該菌的培養基成分和培養工藝參數，然后以5 L發酵罐擴大培養來驗證優化結果，旨在為該食品級重組酵母的工業化應用提供理論依據和參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及質粒

宿主菌乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)GG799株、表達載體pKLAC1由本實驗室保藏?？赏瑫r降解AFB1和ZEN兩種毒素的食品級重組乳酸克魯維酵母GG799(pKLAC1-ZPF1)由本實驗室構建[18]，其中ZPF1為能同時降解AFB1和ZEN兩種毒素的融合酶。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)液體培養基：1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖，加蒸餾水至1.0 L，調pH 6.0，115 ℃滅菌20 min備用。

YEPD固體培養基：1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖、2.0%瓊脂粉，加蒸餾水至1.0 L，調pH 6.0，115 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右混勻后注入9 cm直徑滅菌的平皿，冷卻后備用。

黃豆芽培養基：稱取適量黃豆芽于蒸餾水中，煮沸并維持30 min，過濾棄濾渣，加入20.0 g葡萄糖，再加水至1.0 L，115 ℃滅菌20 min備用。

脫脂乳培養基：7%白砂糖和12%脫脂乳粉，加蒸餾水至1.0 L，于110 ℃滅菌15 min備用。

麥芽汁培養基：根據市售麥芽汁培養基濃縮液說明書，用蒸餾水進行稀釋，115 ℃滅菌20 min備用。

馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養基：稱取200.0 g去皮、切塊的馬鈴薯于蒸餾水中，煮沸并維持30 min，趁熱過濾棄濾渣，加入20.0 g葡萄糖，再加水至1.0 L，115 ℃滅菌20 min備用。

1.2 儀器與設備

SBA-40ES雙通道生物傳感分析儀，濟南延和生物科技有限公司；5 L微生物發酵罐，上海百侖生物科技有限公司；Mobile Minor噴霧干燥機，中國基伊埃工程技術有限公司；SCIENTZ-10 N真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZQZY-70B振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；1300系列Ⅱ級A2型生物安全柜，美國賽默飛世爾科技公司；LDZX-50kBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；超高效液相色譜串聯四級桿質譜聯用儀，美國沃特世公司；Synergy H1多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；LRH-70生化培養箱，上海一恒儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養方法

菌株活化：從-80 ℃冰箱中取出保存的重組乳酸克魯維酵母GG799(pKLAC1-ZPF1)甘油管，劃線接種于YEPD固體培養基平板中，30 ℃培養3～5 d進行活化。

一級種子液培養：挑取平板上的單菌落接種于100.0 mL YEPD液體培養基中，于30 ℃、220 r/min培養18～22 h。

二級種子液培養：按照體積分數1%的接種量將一級種子液轉接于含有500.0 mL YEPD培養基中，于30 ℃、220 r/min培養18～22 h。

發酵罐高密度培養：按照體積分數5%的接種量將OD600=1.0的二級種子液轉接于含有2.0 L培養基的5 L發酵罐中，于28 ℃、220 r/min、通氣量1.5 vvm條件下培養18～35 h。

1.3.2 基礎培養基的篩選方法

將一級種子液分別接入YEPD液體培養基、麥芽汁培養基、PDB培養基、黃豆芽培養基、脫脂乳粉培養基中，各培養基體積均為500.0 mL。于30 ℃、200 r/min培養28 h，每隔2～4 h取樣，測定OD600值。根據數據繪制生長曲線，選擇最佳基礎培養基。

1.3.3 培養基成分的優化方法

1.3.3.1 單因素試驗

1.3.3.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4為主要參考因素，設計5因素3水平響應面試驗表，如增強出版附件表2所示。根據響應面試驗數據和分析結果，確定復合因素下的最佳培養基成分。

1.3.4 培養參數的優化方法

1.3.4.1 單因素試驗

按照1.3.3的最佳培養基成分，進行培養參數的單因素優化試驗，方案如增強出版附件表3所示。測定生物量和活菌數以確定單因素下的最佳培養基成分。

1.3.4.2 正交試驗

根據1.3.4.1單因素試驗結果，設計3因素3水平的正交試驗以確定復合因素下的最佳培養參數，方案如增強出版附件表4所示。

1.3.5 發酵罐擴大培養試驗方法

經過幾十年發展，電力通信技術取得較大進步，已與電力工業深度融合，構成支撐智能電網建設的關鍵業務基礎。由于具備單位質量輕、傳輸衰減小、抗干擾能力強、保密性好等優點，當前，電力通信光纜已取代電纜、高壓電力線和微波等，成為現代電網通信線路的主要載體。

1.3.5.1 發酵罐擴大培養方法

按照1.3.3和1.3.4試驗得到的最佳培養基成分和最佳培養條件，對重組酵母進行5 L發酵罐高密度培養試驗。具體參數如下：裝液量2.0 L，接種量5%，接入OD600=1.0的二級種子液。發酵初始條件：28 ℃、通氣量1.5 vvm?？刂瓢l酵過程中溫度28 ℃、溶氧100%。培養基pH優化：使用優化后的培養基和培養條件，探究3種不同pH(4.5、5.0、5.5)對重組酵母高密度培養時生物量的影響。每隔一定時間取樣，測定生物量和剩余葡萄糖濃度。

1.3.5.2 樣品預處理及相關測定方法

在整個擴大培養過程中，周期性取菌液檢測細胞干重和葡萄糖濃度。細胞干重測定方法[19]：取50.0 mL發酵液于離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄上清液收集菌體。將菌體用去離子水洗滌后，放入干燥箱中于80 ℃干燥至恒重，稱重并計算細胞干重。葡萄糖濃度測定采用SBA-40ES雙通道生物傳感分析儀進行。

2 結果與分析

2.1 重組乳酸克魯維酵母基礎培養基的篩選

選擇YEPD培養基、麥芽汁培養基、黃豆芽培養基、PDB培養基和脫脂乳培養基，在30 ℃、200 r/min條件下培養0～30 h進行對比和篩選試驗?；A培養基篩選試驗結果見圖1。從圖1可知，重組酵母細胞生長密度達到最高時的OD600值分別為：YEPD(4.43)>麥芽汁培養基(3.73)>黃豆芽培養基(3.58)>PDB(3.52)>脫脂乳粉(2.99)。因此，選擇YEPD培養基為最佳基礎培養基。在5種不同培養基的培養下，重組乳酸克魯維酵母的生長趨勢接近。0～8 h處于調整期，菌體生長較緩慢；在8 h后進入對數期，菌液逐漸渾濁；在18 h時進入穩定期，活菌數進入動態平衡。

圖1 不同基礎培養基對重組酵母生長的影響Fig.1 Effects of different culture media on the growth of recombinant yeast strains

對數生長后期或穩定期前期的菌體基本已經是成熟細胞，具有較強的抗干燥和抗冷凍能力，有利于后續菌體干燥工藝下的細胞存活率，所以該時期為最佳的菌體收獲時間[20]。本實驗中將培養20 h定為重組乳酸克魯維酵母菌體細胞收集的最佳時間點。

2.2 培養基成分優化試驗結果

2.2.1 單因素優化試驗結果

2.2.1.1 最佳碳源篩選結果

不同菌種需要不同的生長條件，在培養過程中所需要的碳源種類也不同[21]。在以YEPD為基礎培養基，于30 ℃、200 r/min條件下培養20 h時，其生物量約為(1.15±0.15) g/L，活菌數約為(2.05±0.36)×108CFU/mL，本研究以YEPD在此條件下獲得的生物量和活菌數為后續條件優化的對照數據。

通過向基礎培養基增添碳源物質來篩選最佳的碳源及其濃度，可以有效增加菌種的生物量和活菌數。圖2顯示了不同碳源及其濃度對重組酵母生長的影響。

a-細胞干重；b-活菌數圖2 不同碳源及其含量對重組酵母生長影響Fig.2 Effects of different carbon sources and concentrations on the growth of recombinant yeast strain

從圖2可知，隨著葡萄糖、麥芽糖、乳糖3種碳源濃度的增加，生物量和活菌數呈現先增大后減小的趨勢，其中葡萄糖的質量濃度在20.0 g/L時，生物量和活菌數最高，分別為4.98 g/L和3.86×108CFU/mL。隨著蔗糖濃度的不斷增加，活菌數呈現不斷上升趨勢，可能因為蔗糖比葡萄糖有更強的維持培養基低滲環境的效應，高濃度下更有利于菌體生長，但整體均小于20.0 g/L葡萄糖所達到的活菌數[16]。糖蜜是制糖工業副產品，其中含有蔗糖、葡萄糖、乳糖等多種糖類，是較為理想的低成本材料。但在本研究中效果不如葡萄糖和蔗糖?？紤]到作用對比的實際效果，本研究選擇在低濃度時對菌株生長有明顯促進作用的20.0 g/L的葡萄糖作為碳源。

2.2.1.2 最佳氮源篩選結果

米糠和麩皮是農作物加工中的副產品，含有豐富的脂肪、粗蛋白、粗纖維和維生素，可以為微生物發酵提供氮源[16]。本研究針對上述有機和無機氮源對重組酵母生長影響進行了研究，結果圖3所示。

a- 不同有機氮源及其含量下的細胞干重；b- 不同有機氮源及其含量下的活菌數； c- 不同無機氮源及其含量下的細胞干重；d- 不同無機氮源及其含量下的活菌數圖3 不同氮源及其含量對重組酵母生長影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources and concentrations on the growth of recombinant yeast strain

從圖3-c和圖3-d可知，無機氮源基本無法使菌體正常生長。高恩燕[16]研究了無機氮源NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4NO3對乳源馬克思克魯維酵母的生長影響也發現，相對于空白組，無機氮源的添加不利于菌株的增殖，本實驗中乳酸克魯維酵母對無機氮源利用情況與該文獻結果相似。由圖3-a和圖3-b可知，當蛋白胨、米糠、麩皮作為唯一氮源時，其生物量和活菌數都達到較高水平，其中米糠作為氮源時的生物量最高，達到13.32 g/L。麩皮作為氮源時的活菌數最高，達到6.03×108CFU/mL，而蛋白胨和酵母提取物作為氮源時的活菌數基本與麩皮差不多。但是，考慮到本試驗使用的麩皮和米糠顆粒粗大，本身含有的纖維可能占有一定的質量，且粗糙顆粒的不均勻性不利于重組酵母制劑化制備，為避免米糠和麩皮粗顆粒對后期研究的影響，本實驗研究選取40.0 g/L蛋白胨和20.0 g/L的酵母提取物作為氮源進行后續研究。

2.2.1.3 最佳無機鹽篩選結果

微生物生長中的各類代謝活動需要各種無機鹽離子來參與調節，如可以調控細胞通透性和滲透壓的K+、Na+、Ca2+等，可以調節細胞內部相關酶活性的Mg2+、Fe3+等[22]。研究了不同無機鹽對重組酵母的影響。從圖4可知，在基礎培養基中添加KCl和CaCl2時，隨著濃度的增加，重組酵母生物量相比對照組稍有增加，但增加量不顯著；而KCl在較低的濃度下活菌數反而明顯降低，CaCl2濃度對活菌數影響呈一定的波動?？傮w而言，KCl、CaCl2對重組酵母生長沒有明顯促進作用。KH2PO4添加量對活菌數呈現先增加后降低的趨勢，在KH2PO4質量濃度4.0 g/L時，生物量達到最大為6.56 g/L，活菌數則在質量濃度6.0 g/L時達到最大值3.88×108CFU/mL。同時發現，隨著MnSO4濃度的增加，重組酵母生物量和活菌數減少趨勢相當明顯，說明額外添加MnSO4會抑制該菌株的生長。而添加的MgSO4在較低濃度下表現出對該菌株生物量和活菌數的明顯促進效應。綜合分析上述結果，考慮到培養基成本因素，選取4.0 g/L的KH2PO4和0.5 g/L的MgSO4為培養基最佳添加無機鹽，以便后續研究。

a-細胞干重；b-活菌數圖4 不同無機鹽及其含量對重組酵母生長影響Fig.4 Effects of different inorganic salts and concentrations on the growth of recombinant yeast strain

2.2.2 響應面試驗優化結果

根據上述單因素篩選結果，選擇葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4為考察目標進行響應面試驗，對培養基進行綜合優化。試驗結果如增強出版附件表5所示，回歸模型如回歸方程所示，方差分析如增強出版附件表6所示。對附表5中實驗數據進行回歸分析，可得回歸方程為：Y=6.14+0.344 3A-0.0521B-0.024 1C-0.025 6D-0.180 6E+0.043 5AB-0.269 8AC+0.089 3AD+0.177 0AE+0.112 0BC+0.359 0BD+0.182 0BE-0.789 0CD+0.177 0CE+0.248 5DE-0.277 1A2-0.346 3B2-0.203 8C2+0.058 3D2-0.157 0E2。式中Y為響應值，即酵母生物量；A、B、C、D、E分別表示葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、KH2PO4、MgSO4的添加量。

從增強出版附表6方差分析可以看出，該模型非常顯著(F=69.28，P<0.000 1)，失擬項(F=0.288 8，P=0.973 6>0.05)，相關系數R2=0.983 0，校正系數R2=0.968 8，說明該試驗結果誤差小，模型與實際預測值擬合效果較好，可以使用該模型來分析響應值的變化。模型中的參數A、E、AC、AE、BD、CD、CE、DE、A2、B2、C2、E2對重組酵母的生物量的提高有顯著影響，AB項作用效果不顯著。

多維因素相互作用的響應面優化試驗結果如圖5所示，按參考文獻[16]方法分析響應面等高線變化速度和3D曲面圖的斜度，觀察并比較分析5個因素對響應值影響大?。阂訟(葡萄糖)、B(蛋白胨)、C(酵母提取物)、D(KH2PO4)、E(MgSO4)的含量為影響因子，以生物量即細胞干重為響應值進行響應面試驗。

a-葡萄糖質量濃度-蛋白胨質量濃度；b-蛋白胨質量濃度-酵母提取物質量濃度 c-蛋白胨質量濃度-MgSO4質量濃度；d-酵母提取物質量濃度-MgSO4質量濃度圖5 多維因素相互作用的響應面優化結果Fig.5 Response surface optimization results with multi-dimensional factors interactions

試驗對應的3D曲面圖及等高線圖部分提示：與A(葡萄糖)相比，B(蛋白胨)方向等高線變化速度快，3D曲面的斜度也更大。由此可知蛋白胨對細胞干重的影響大于葡萄糖。同理，蛋白胨對細胞干重的影響也大于酵母提取物、MgSO4。對方程進行求解，可得到重組酵母生物量最大時的培養基最佳組成為：葡萄糖20.41 g/L，蛋白胨30.46 g/L，酵母提取物24.73 g/L，KH2PO44.48 g/L，MgSO40.65 g/L。在該條件下進行培養試驗，得到的酵母菌體生物量最大值為(6.35±0.17) g/L，是以YEPD為基礎培養基條件下重組酵母生物量的5.5倍。因此通過響應面優化后得到的培養基成分組成優勢明顯，可進行后續試驗研究。

2.3 培養參數優化試驗結果

2.3.1 培養參數的單因素優化試驗結果

采用上述優化的培養基組分，探討了不同溫度、轉速和pH等參數對重組酵母生長的影響，以活菌數為考量指標，單因素優化結果如圖6所示。從圖6-a可知，重組酵母的生物量和活菌數均隨著溫度的升高呈現先升后降趨勢。在28 ℃時生物量和活菌數達到最大，分別為6.52 g/L、3.35×108CFU/mL。從圖6-b可知，當轉速為200 r/min時，重組酵母的生物量和活菌數達到最高，分別為6.63 g/L、2.90×108CFU/mL。從圖6-c可知，重組酵母的最佳生長pH為5.0。當pH高于或者低于5.0時，對活菌數會造成較大的影響。

a-培養溫度；b-培養轉速；c-培養基pH圖6 不同溫度、轉速和pH對重組酵母生長的影響Fig.6 Effects of different temperatures, agitation speeds and pH conditions on the growth of recombinant yeast strain

2.3.2 培養參數的正交優化試驗結果

對重組酵母的培養參數進行了正交試驗優化，結果如表1所示。從表1的極差分析結果可以看出，溫度(A)、轉速(B)、pH(C)三種培養參數對重組酵母生長的生物量影響程度大?。篟C>RB>RA，優化后方案為C1B3A1。

表1 培養條件優化的正交試驗結果Table 1 Orthogonal tests results of culture parameters

綜合以上結果，培養參數的最佳組合為：溫度26 ℃、轉速220 r/min、初始pH 4.5。在此條件下重復3次試驗，獲得重組酵母生物量為(8.62±0.22) g/L，該結果是以YEPD為基礎培養基，于30 ℃、200 r/min條件下培養20 h時重組酵母生物量的7.5倍。

2.4 發酵罐擴大培養試驗結果

為使得優化后的工藝條件能夠更好地應用于工業化生產，對該重組酵母進行了5 L發酵罐放大培養試驗，驗證上述優化條件下的高密度培養結果。按照上述優化的培養基最佳組成和最佳培養參數進行發酵罐培養試驗，收獲的生物量與培養基葡萄糖含量變化結果見圖7。發酵進行到18～20 h時，培養基葡萄糖含量基本耗盡，需要對其進行恒速補料?？紤]到搖瓶培養方式下優化培養參數時，發現pH對重組酵母的生長有較大影響，故在發酵罐試驗中再次對pH進行了梯度優化試驗，結果表明使其恒定在pH 5.0條件下，此時重組酵母生長最好，培養35 h其生物量達到(34.05±3.34) g/L，是以YEPD為基礎培養基、于30 ℃、200 r/min條件下培養20 h時重組酵母生物量的29.6倍。

a-細胞干重；b-培養基葡萄糖含量圖7 不同pH下重組酵母5 L發酵罐擴大培養結果Fig.7 Expended cultivation of recombinant yeast strain in 5 L fermentor at different pH conditions

3 結論與討論

乳酸克魯維酵母GG799(pKLAC1-ZPF1)是一種可同時降解AFB1和ZEN的食品級重組酵母，對食品和飼料行業原料中真菌毒素的降解具有重要潛在應用價值。本研究在單因素試驗優化的基礎上，利用響應面試驗和正交試驗優化了該重組酵母的培養基成分和培養參數。確定了搖瓶培養優化的培養基最佳成分為：葡萄糖20.41 g/L、蛋白胨30.46 g/L、酵母提取物24.73 g/L、KH2PO44.48 g/L、MgSO40.65 g/L；最佳培養參數為：26 ℃、220 r/min、初始pH 4.5。在上述優化條件下進行發酵罐擴大培養并繼續優化了培養pH，獲得的生物量是搖瓶培養對照條件下的29.6倍。本研究優化并提高了食品級重組乳酸克魯維酵母的生物量，為GG799(pKLAC1-ZPF1)株將來工業化應用提供了重要理論依據和參考數據。