丁香精油微膠囊的制備及其對草莓保鮮效果的研究

黎漢清，羅文翰*，肖更生*，張雪琴，施璇云，藍碧鋒，肖乃玉

1(仲愷農業工程學院，包裝工程系，廣東 廣州，510225)2(廣州輻銳高能技術有限公司，廣東 廣州，511458)

草莓果體柔軟，表皮脆弱，在采摘和運輸過程中極易造成機械損傷和生物病害，從而失去食用價值[1]。植物精油應用于果蔬采后保鮮，可以顯著降低病害的發生，延長果蔬貨架期[2-4]。丁香精油本身具有抑菌防腐的作用，但極易揮發，通過微膠囊技術對其包埋，可增加丁香精油的穩定性，并具有一定的緩釋效果，既可以解決天然植物精油易揮發的問題，又能將其應用于果蔬保鮮。IGNAICO等[5]將大豆分離蛋白、蒙脫土和丁香精油做成膜，用于金槍魚的冷藏保鮮；潘小軍等[6]發現，0.1%的丁香精油對青霉菌的抑制作用達到100%，損傷接種試驗處理4 d的柑橘無腐敗現象。但是目前大部分文獻報道的是將包合物在果蔬上涂膜保鮮，包合物直接與果蔬接觸，植物精油殘留的味道會影響消費者的感官體驗。

本研究通過β-環糊精制備丁香精油微膠囊，β-環糊精無毒性、可大量生產，包埋精油后不僅可以掩蓋精油的味道，同時還能防止精油的氧化[7]，做成粉劑后放入無紡布袋中用于草莓保鮮，利用其揮發性物質的抗菌作用，不需接觸果蔬，可替代化學添加劑，有效保障果蔬質量及市場的供應。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

丁香精油(丁香酚含量為70%)，自制；β-環糊精，天津百世化工有限公司；吐溫-80，湖北諾納科技有限公司；無水乙醇(≥99.5%)，天津大茂化學試劑廠；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)，上海博微生物科技有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、葡枝根霉、灰葡萄孢霉、黑曲霉，上海保藏生物技術中心；食品級無紡布袋(9 cm×7 cm)，保定企翔紡織品加工有限公司；PE保鮮袋，25 cm×35 cm，厚度15 μm，寧波新力包裝材料有限公司；碩豐草莓，廣州市白云區丹丹牛奶草莓園。

1.2 實驗設備

Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀，美國PE公司；Mettler tga 2熱重分析儀，瑞士梅特勒-托利多集團；Sigma 300掃描電子電鏡，卡爾蔡司集團；LF-NMR, NM60紐邁低場核磁共振儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；艾德堡果實硬度計，漳州市艾德堡食品有限公司；手持折光儀，力辰儀器科技有限公司；生化培養箱，上海葉拓科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 丁香精油抑菌實驗

抑菌實驗采用濾紙片抑菌法。吸取0.1 mL菌懸液于滅好菌并凝結的PDA上，涂布均勻。用滅菌鑷子夾住浸泡在精油中的濾紙片，放在平板中央；細菌抑菌實驗，需將平皿倒置放于37 ℃生化培養箱中培養18～24 h；真菌平皿正置放于28 ℃培養箱中培養3～5 d，用十字交叉法量取抑菌圈大小，取平均值，平行3次。

1.3.2 丁香精油微膠囊的制備

量取36 mL的去離子水，在磁力攪拌器上加熱到50 ℃時加入6 g β-環糊精，攪拌，加入0.2 mL吐溫-80，準備1 mL丁香精油，用無水乙醇將丁香精油按體積比1∶1稀釋，用針管逐滴加入丁香精油后，密閉攪拌1.5 h，冷卻，放入4 ℃冰箱沉淀24 h，抽濾，40 ℃干燥成粉狀[8-9]。

1.3.3 丁香精油微膠囊的性能

1.3.3.1 包埋率

用無水乙醇配制梯度濃度的丁香精油乙醇溶液；用紫外分光光度計進行光譜掃描，確定特征吸收峰在202 nm，繪制丁香精油標準曲線，標準曲線方程為y=0.476 4x+0.130 4,R2=0.998 6。稱取0.01 g丁香精油微膠囊粉末，與無水乙醇混合，離心，取上清液，測定其吸光度，按公式(1)計算包埋率：

(1)

式中：精油總量為0.01 g丁香精油微膠囊中精油完全被環糊精包埋理論值。

1.3.3.2 掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)

將樣品固定在導電膠上，噴金處理，加速電壓為3 kV，掃描電鏡觀察。

1.3.3.3 傅里葉紅外光譜

將樣品與KBr混合壓片后，采用傅里葉紅外光譜進行測試，掃描范圍4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為16。

1.3.3.4 熱重測試

稱取3～5 mg樣品于小坩堝中，放入熱重分析儀，熱重測試溫度50～600 ℃，升溫速度10 ℃/min，氮氣流速100 mL/h。

1.3.3.5 緩釋能力測試

準確稱取3份0.500 0 g丁香精油微膠囊粉末于稱量瓶中，稱取總質量，將稱量瓶放入玻璃干燥器中，瓶口傾斜45°，并于28 ℃下放置，在0～10 d，每天測量丁香精油微膠囊粉末與稱量瓶的總質量，計算丁香精油微膠囊緩釋性能，按公式(2)計算緩釋率:

(2)

1.3.4 微膠囊對草莓保鮮品質的影響

模仿市場上草莓包裝方式，分別稱取2、4、6 g丁香精油微膠囊粉末(編號為丁2、丁4、丁6)以及4 g β-環糊精粉末(空白組)，分裝于無紡布袋，為便于觀測，分別裝在含有8顆草莓的托盤中，用PE保鮮袋熱封處理，體積約為500 cm3，放置在28 ℃恒溫箱中保藏，分別在第1、3、5、6、7、8天進行指標測試，每組平行3次。

1.3.4.1 腐爛率測定

參照陳建中等[10]的方法。

1.3.4.2 硬度測定

用艾德堡硬度計測定草莓的硬度。探頭直徑5 mm，壓距5 mm。取每個測量結果的最大值，重復3次，取平均值[11]。

1.3.4.3 失重率

參照姚軍等[12]的方法。

1.3.4.4 核磁共振測定

將待測樣品放入樣品管中，并放入儀器樣品池中進行測試，參數設置為：信號采集點數為539 990，主頻率為21，重復采集次數為5 500，回波個數為18 000。

1.3.4.5 可溶性固形物測定

參照金思淵等[13]的方法。

1.4 數據處理

采用Origin Pro 2020進行做圖， SPSS Statistics 25 進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 丁香精油抑菌效果

草莓采后病害主要以灰霉病和炭疽病為主[14]，致病菌以灰葡萄孢霉和黑曲霉為代表，用丁香精油對常見細菌和草莓致病真菌進行抑菌實驗，抑菌效果如圖1所示，對黑曲霉的抑制效果最佳。

圖1 丁香精油抑菌圈直徑Fig.1 Diameter of inhibition zone of clove essential oil

2.2 微膠囊性能表征

2.2.1 掃描電鏡

通過計算丁香精油包埋率為60.5%。通過SEM觀察β-環糊精與丁香精油微膠囊的形態可知，β-環糊精晶體本身呈菱形或棱柱形，結構厚實，表面平滑，整體性較強[16]。當丁香精油和β-環糊精制成微膠囊后，晶體結構發生變化，β-環糊精菱形晶形消失，微膠囊晶體結構相對β-環糊精變得蓬松，表面粗糙且附著顆粒，與CHEN 等[17]的研究結果相似。

a-β-環糊精；b-丁香精油微膠囊圖2 掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy

2.2.2 紅外光譜分析

圖3 β-環糊精、丁香精油、丁香精油微膠囊紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of β-cyclodextrin, clove essential oil, clove essential oil microcapsule

2.2.3 熱重分析

熱重分析結果如圖4所示。第一個失重區域小于100 ℃，β-環糊精和β-環糊精丁香精油包合物均失重，可能是β-環糊精以及丁香精油中的自由水以及易揮發的物質受熱損失[19]，在100～300 ℃，β-環糊精失重緩慢，失重速度接近0，而β-環糊精丁香精油包合物失重較快但失重速度小于第一個失重區域，這可能是因為β-環糊精里的水分已經完全蒸發，隨著精油持續揮發，丁香精油微膠囊在100～300 ℃這個溫度區間出現失重現象；第二個失重區域是由于β-環糊精發生熱分解引起的失重，β-環糊精的熱分解反應在315.5 ℃開始，到350 ℃結束，之后兩者不再受溫度的影響而發生變化。

a-TG;b-DTG圖4 丁香精油微膠囊與環糊精的熱重圖Fig.4 Clove essential oil microcapsule with cyclodextrin thermogravimetric images

2.2.4 緩釋分析

圖5為丁香精油微膠囊在28 ℃環境下進行的緩釋實驗結果，丁香精油微膠囊的緩釋率隨著時間的增加，緩釋速度先增大后逐漸降低，這可能是由于前期丁香精油微膠囊中水分、附著在表面的丁香精油的揮發，導致緩釋速度變大[20]，第4天后，緩釋速度逐漸降低，這是已包埋的丁香精油緩慢釋放，第11天，丁香精油微膠囊的緩釋速度趨于平緩，緩釋率約為25%，表明丁香精油微膠囊化確實降低了丁香精油的揮發，并有一定的緩釋效果。

圖5 丁香精油微膠囊緩釋圖Fig.5 Sustained release image of clove essential oil microcapsule

2.3 微膠囊保鮮效果

2.3.1 腐爛率分析

與空白組相比，丁香精油微膠囊粉末對草莓的新鮮度有一定的保鮮效果。圖6可以看出，所有組在貯藏1 d后都沒有出現腐敗現象，第3天后開始腐爛，草莓在空白組的情況下，只能貯藏5 d，之后腐爛加劇不可食用。草莓保存至第8天，空白組、丁2、丁4、丁6腐爛率分別為65%、37%、31%、41%，可見丁4的保鮮效果最佳，丁2效果相似，丁6保鮮效果一般但優于空白組。表1給出了第1、5、8天的表觀照片，與腐爛率結果相一致，空白組在貯藏的第5～6天腐爛速度加快，在第7天達到了55%，實驗組僅約為30%，表明丁香精油微膠囊通過抑制腐敗菌的生長，在常溫下延長草莓貨架期2 d。

圖6 草莓腐爛率的變化Fig.6 Changes in rot rate of strawberry

表1 草莓貯藏期間形貌變化Table 1 Morphology changes of strawberry during storage

2.3.2 硬度分析

果實硬度是指果實表皮及纖維組織在受壓時所能承受的力，其大小與水果的果膠含量有關。果膠被果膠酶分解后，果實硬度會逐漸降低[21]。圖7表明，4組草莓的硬度均逐漸降低，其中空白組降低得最快，保存至第8天時，硬度僅有0.743 kg/cm2，丁2、丁4、丁6組較空白組均有較好的硬度，其中丁4的硬度下降得最少，保存至第8天時，硬度有1.5 kg/cm2，較第1天(2.3 kg/cm2)硬度減少0.8 kg/cm2。

圖7 草莓硬度的變化Fig.7 Changes in hardness of strawberries

2.3.3 失重率

草莓果實水分含量高，在保鮮期間容易失水造成果實皺縮，由圖8可以看出，草莓在貯藏期間，失重率逐漸增加，且空白組的失重率最高，增加的趨勢最明顯，特別是保鮮的第1～5天，這可能是因為草莓被霉菌侵染，草莓腐爛加劇，導致草莓新陳代謝加快，失重率增加。丁2、丁4、丁6三組均有較好的保鮮作用，第1～5天，3組的保鮮效果基本一致，第5～8天，丁6的保鮮效果差于丁2與丁4組，丁2與丁4組的效果十分接近，在第8天時，丁2與丁4組的失重率分別為15.8%與14.93%，失重率的明顯增大，可能是因為在貯藏期間溫度高，草莓的呼吸強度大所致。

圖8 草莓失重率的變化Fig.8 Changes in weight loss rate of strawberry

2.3.4 低場核磁共振分析

由圖9可以看出，在0～5 d，隨著草莓呼吸作用，自由水散失；在5～6 d，草莓逐漸軟化，果實的果膠和纖維素被降解，此階段自由水含量增加，不易流動水以及結合水減少，偽彩圖表明空白組與丁6組的藍色區域明顯增加，表現為空白>丁2>丁6>丁4；7～8 d，草莓腐爛，果實內水分流失，3種水分均減少，丁4組較其他組變藍時間更長，說明丁4能夠更好地起到抑菌的作用，使草莓貨架期延長2 d。結合草莓的腐爛率和失重率，處理組與空白組相比具有較好的保鮮效果。

圖9 草莓核磁共振水分分布情況圖和偽彩圖Fig.9 Nuclear magnetic resonance water distribution map and pseudocolor map of strawberry

2.3.5 可溶性固形物含量變化

草莓的可溶性固形物也是草莓的總糖量，其含量直接影響其風味，可溶性固形物在草莓保存時含量變化，會影響草莓的口感與品質[22]。由圖10可見，處理組的可溶性固形物總體上變化不大，而空白組的可溶性固形物明顯減少，空白組在第8天由11.8%減少至5%，丁2組由11.5%降為7.7%，丁4組由11.7%降為9.1%，丁6組由11.5%降為9%。

圖10 草莓可溶性固形物含量的變化Fig.10 Changes of soluble solids content in strawberry

3 結論

本文首先確定了丁香精油對常見細菌和草莓致腐菌的抑菌效果，然后選取β-環糊精作為壁材，包埋丁香精油，通過表征，證明微膠囊成功包埋，且具有較好的緩釋效果。將微膠囊應用在草莓保鮮中，通過實驗結果表明空白組腐爛率為65%，高于實驗組，空白組和實驗組的失重率較為接近，空白組由于腐敗菌侵蝕嚴重，硬度下降程度遠遠高于實驗組，核磁結果顯示隨保鮮時間的增加，空白組與實驗組自由水逐漸增加，相比較下實驗組保鮮效果優于空白組，可有效延長草莓貨架期2 d，對草莓新型保鮮劑的開發具有一定的應用價值。