乙烯和1-甲基環丙烯對蛹蟲草蟲草素含量的影響

孫強，馬矜爍，廉添添，管歌

1(新鄉醫學院三全學院 生命科學技術學院，河南 新鄉，453003) 2(新鄉醫學院三全學院 藥學院，河南 新鄉，453003)

蛹蟲草Cordycepsmilitaris(L.) Link作為蟲草屬的模式種，也是子囊菌中重要的食藥用真菌，含有多種藥用功能成分物質。蟲草素(cordycepin)即3′-脫氧腺苷(3′-deoxyadenosine)是其中重要的活性成分，具有抗菌、抗腫瘤、調節免疫、降血糖等多種藥理作用及治療代謝紊亂、氧化損傷等多種疾病的潛能[1]。

不同濃度的乙烯對真菌生長和發育的影響效果具有很大差異，高濃度乙烯會抑制灰霉菌(Botrytiscinerea)菌絲的生長及雙孢蘑菇菌絲的生長和子實體的形成[2]，而低濃度的乙烯則會促進灰霉菌菌絲的生長、芽管的伸長和附著胞的形成[3]。圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)在形成氣生菌絲和分生孢子時伴隨有乙烯迅速、大量的合成，若人為抑制乙烯的合成，則不能形成成熟的分生孢子，其萌發率降低90%[4]。

乙烯利不僅自身能夠釋放乙烯，并且在一定條件下能夠誘導植物產生乙烯。目前已知的多種真菌均能夠產生乙烯，但其合成途徑與高等植物有所不同，不是由甲硫氨酸經1-氨基環丙烷1-羧酸途徑產生，而是由甲硫氨酸經2-酮-4甲基硫代丁酸途徑或由谷氨酸經酮戊二酸途徑產生[5]。促進乙烯或者抑制乙烯的合成，可加速或者延緩植物果實后熟進程，在食用菌中，這一調控作用也同樣存在[6]。研究發現在雞腿菇的液體培養中添加乙烯利，能夠有效地促進雞腿菇菌絲的生長，顯著提高菌絲體干重[7]；在雙孢菇的研究中，研究人員發現乙烯利能誘導增加乙烯釋放量，加速雙孢菇子實體離體后的衰老進程[8]。

1-甲基環丙烯(1-methylcyclopropene, 1-MCP)是一種小環烯烴氣體，性質活潑，能阻止乙烯與其受體的結合從而導致乙烯信號轉導受阻，是一種有效的乙烯拮抗化合物，可用于植物采摘后成熟期的延長[9-11]。1-MCP在香蕉的成熟反應中有防止軟化的作用[12]，SISLER等[13]通過研究環丙烯、1-MCP和3,3-二甲基環丙烯在許多植物中減弱乙烯的效應，提出這些新型抑制劑可用于植物壽命的延長，尤其是1-MCP在康乃馨、香蕉、豌豆苗等植物中的作用已得到驗證。在食用真菌平菇中，1-MCP對采后子實體生理及貯藏品質方面都有著積極的影響[14]。而乙烯及其拮抗劑對蛹蟲草中蟲草素合成的影響尚未見報道。本研究通過蛹蟲草栽培試驗，探索不同濃度乙烯利和乙烯受體抑制劑1-MCP對蛹蟲草子實體后期成熟產生蟲草素含量的影響，為提高栽培蛹蟲草中蟲草素含量、改善蟲草素品質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

蛹蟲草CGMCC 3.16321菌株，中國科學院菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，加水定容至1 L，測得pH值6左右，121 ℃高溫滅菌30 min。

栽培培養基：30 g小麥添加40 mL 營養液，121 ℃高溫滅菌1 h。

栽培營養液：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，檸檬酸銨 1 g，維生素B120 mg，加水定容至1 L，121 ℃高溫滅菌30 min。

1.1.3 試劑與設備

乙烯利、1-MCP、蛋白胨、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸銨、維生素B1等化學試劑，國藥集團公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒，日本Toyobo公司。

7500Fast實時定量熒光PCR儀器，Applied Biosystems公司；LC-20AT高效液相色譜，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件

平板活化：將實驗室保存的菌種斜面轉到PDA平板上，22 ℃避光培養7～10 d。

搖瓶培養：用8 mm打孔器從活化好的平板菌落邊緣打孔，將菌種塊轉移到液體培養基中。每瓶接種3塊，22 ℃，150 r/min搖床培養3～4 d。

子實體栽培培養：每個栽培培養瓶接種5 mL液體種子，22 ℃黑暗培養7 d至菌絲布滿培養基表面和底部，進行光照(12 h/d白光光照)，22 ℃培養，原基形成階段搔菌并給予5～10 ℃的溫差刺激。培養40～50 d至子實體成熟。乙烯組在培養40 d時，每間隔12 h噴灑乙烯利溶液(質量濃度為100、250、500、750、1 000 mg/L，每個處理重復3次)15 mL于子實體[3]，直至成熟；1-MCP組在培養40 d時，每間隔12 h噴灑1-MCP溶液(質量濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，每個處理重復3次)15 mL于子實體，直至成熟；對照組則是噴灑15 mL無菌蒸餾水于子實體。

1.2.2 實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)

收集各試驗組子實體，用Trizol法提取RNA。將提取的總RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒合成cDNA。然后采用qRT-PCR法檢測嘌呤核苷酸磷酸化酶、腺苷酸琥珀酸合成酶、腺苷酸激酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶基因表達(引物序列見表1)。實時PCR反應體系：ddH2O 6.4 μL，QPCR SYBR Green Mix 10 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，cDNA 模板 2 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，34循環；熔解曲線分析。各試驗樣品都設置3個重復。以延伸因子(actin)作為內參基因，采用2-ΔΔCt法[15]進行相對表達量分析。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.2.3 蟲草素含量測定

蟲草素標準曲線制備：稱取34.6 mg蟲草素標準品溶于10 mL超純水溶液中，終質量濃度為3.46 mg/mL，在10 mL的容量瓶中將蟲草素的終質量濃度再稀釋成不同濃度的5份，用高效液相色譜法測定260 nm處溶液的峰面積[16]，以標準品質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，計算標準曲線，求線性回歸方程。

蟲草素含量測定：將各組子實體采集于45 ℃烘干，研磨成粉，水熱回流，用超純水定容至50 mL，然后過D-101大孔吸附樹脂，旋轉蒸發定容至10 mL，用高效液相色譜法測定260 nm處溶液的峰面積，代入標準曲線方程，得蟲草素質量濃度。

2 結果與分析

2.1 蟲草素合成相關基因表達量分析

2.1.1 外源乙烯處理結果

不同濃度的乙烯利處理子實體后，各組子實體中PNP、Adss、AK、Adsl基因相對表達量均上調(圖1)，其中乙烯利質量濃度為100 mg/L的處理組基因表達量上調最為明顯，PNP、Adss、AK、Adsl四組基因相對表達量上調的倍數分別為3.219、3.775、3.584和2.646。由此可知，乙烯作為誘導物對蛹蟲草次級代謝產物蟲草素合成起到了正調控作用，并且通過濃度試驗證明過量的乙烯對于這種促進作用效果不明顯。

圖1 不同劑量乙烯處理下蟲草素合成相關基因的表達量Fig.1 Relative expression levels of genes related to cordycepin biosynthesis under different doses of ethylene注：**表示極顯著差異(P<0.01)(下同)

2.1.2 乙烯阻斷劑處理結果

不同濃度的1-MCP處理子實體后，以actin作為內參基因，PNP、Adss、AK、Adsl四組基因相對表達量均下調(圖2)，其中質量濃度為1.0 mg/L的1-MCP處理組相對表達量下調最為明顯，PNP、Adss、AK、Adsl四組基因相對表達量分別下調至0.484、0.439、0.425、0.495。阻斷乙烯與受體結合后明顯表現出蟲草素相關合成基因的表達下調，但是不能夠完全抑制基因表達，可能是與所研究基因也參與蛹蟲草核苷酸的代謝有關。

圖2 不同劑量1-MCP處理下蟲草素合成相關基因的表達量Fig.2 Relative expression levels of genes related to cordycepin biosynthesis under different doses of 1-MCP

2.2 蟲草素含量測定

2.2.1 蟲草素標準曲線

以峰面積(mAU·s)為y軸，標準品質量濃度(μg/mL)為x軸，繪制標準曲線，結果如圖3所示，其線性回歸方程為：y=34 090.544 380x-1 839.950 667,R2=0.999 989。

圖3 標準曲線Fig.3 Standard curve

2.2.2 蟲草素含量

利用高效液相對樣品進行分析計算蟲草素含量，如圖4所示，對照組中蛹蟲草蟲草素質量濃度為(10.04±0.17) μg/mL，100 mg/L乙烯利處理組蛹蟲草中蟲草素的質量濃度為(25.37±0.22)μg/mL，1.0 mg/L 1-MCP處理組蛹蟲草中蟲草素的質量濃度為(0.52±0.12)μg/mL。由此可知，適當添加外源乙烯可以顯著提高子實體中的蟲草素產生量；而添加乙烯合成阻斷劑后，子實體中蟲草素產量明顯降低，其結果與qPCR結果基本一致。

a-蟲草素對照品；b-樣品圖4 高效液相圖譜Fig.4 HPLC chromatography

3 討論與結論

研究表明，不同濃度的乙烯對蛹蟲草子實體中蟲草素的產生影響不同，適當提高乙烯濃度能夠促進核苷代謝相關基因(PNP、Adss、AK、Adsl)表達量上調，高效液相色譜結果也顯示，子實體成熟后期蟲草素的含量也隨之顯著提高；抑制蛹蟲草自身乙烯的合成，則蟲草素合成相關基因的表達量顯著降低，高效液相色譜結果也表明，子實體后期蟲草素的含量也隨之顯著降低。在一定范圍內，子實體蟲草素含量與外源乙烯添加量呈顯著正相關。

乙烯作為植物激素，可以促進植物的生長，是早已被人們發現的與果實成熟有關的一種氣態激素。近來又發現乙烯不僅能促進成熟，它對植物生長發育也有多方面的效應[17]。許多真菌合成乙烯，ILAG等[18]調查了228種真菌，其中58種(25.6%)可以合成乙烯。EL-SHAROUNY[19]從植物病根中分離的81種真菌中有31%的種產生乙烯。植物合成乙烯的途徑是ACC途徑，在真菌中則有KMBA途徑和ACC途徑，蛹蟲草中存在著ACC途徑[20]。

本研究發現，補充外源乙烯對蛹蟲草子實體中蟲草素合成相關基因的表達量有明顯的上調作用，表明乙烯作用于蟲草素合成途徑可能是：AMP→ADP→dADP→dAMP→蟲草素。通過基因表達量和子實體蟲草素含量分析可以得出腺苷酸琥珀酸裂解酶是該合成途徑的限速酶，此酶基因表達在100 mg/L乙烯利作用下上調(2.09±0.72),與子實體蟲草素的質量濃度由(10.04±0.17)增加到(25.37±0.22)μg/mL，增加約1.5倍，其他基因表達上調均高于實際子實體蟲草素表達水平，此相關合成途徑的基因功能需進一步研究。

用乙烯受體抑制劑1-MCP處理，其結果與乙烯利則相反，與在雙孢菇相關研究中結果一致[21]。本研究中乙烯阻斷劑1-MCP通過與乙烯受體競爭性結合從而導致乙烯信號轉導受阻，進而影響蟲草素合成途徑相關基因PNP、Adss、AK和Adsl的表達，但是這些基因也參與蛹蟲草的核苷酸代謝，存在其他調控途徑，所以1-MCP阻斷乙烯作用后這些基因表達量下調作用不明顯，但是對子實體蟲草素合成影響較大。

乙烯對蛹蟲草子實體后期成熟中蟲草素的含量影響較大，通過調節蟲草素合成過程中相關基因的表達從而影響蛹蟲草栽培后期蟲草素的含量。本研究表明，適當提高栽培環境中乙烯含量(外源添加乙烯利質量濃度100 mg/L)，與對照相比大大提高了蟲草素產生量，建議在蛹蟲草栽培后期合理添加乙烯利，以達到增加子實體蟲草素含量的目的，提高蛹蟲草品質。