熱處理對紅鰭東方鲀魚肉嫩化效果的影響

吳炳存，尚珊，傅寶尚，姜鵬飛，董秀萍，李榮，祁立波*

1(大連工業大學 國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連,116034) 2(大連富谷食品有限公司，遼寧 大連,116400)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)，屬于大形鲀類，主要分布于中國近海(東、黃、渤海)以及長江中下游地區，為海淡水魚類[1]，是偏肉食性的雜食性魚類。因其受應激反應臀鰭變紅而得名。其肉質鮮嫩腴美，蛋白質、脂肪含量豐富，尤其是膠原蛋白含量豐富，其營養成分高，深受廣大消費者的喜愛，適用于各種人群食用[2]，隨著《關于有條件放開養殖河鲀生產經營的通知》的正式發布，河豚魚已經可以被安全食用[3]。目前有關河豚魚肉的加工產品主要集中在冷凍食品包括河豚魚丸、河豚魚水餃等，而對于紅鰭東方鲀的研究則主要集中在養殖以及魚皮膠原蛋白的提取上，對于紅鰭東方鲀魚肉的加工方面少有報道[4]。膠原蛋白是存在于肌肉結締組織中一種豐富的蛋白，是肉嫩度和質地變化的一個促成因素，一般來說，膠原蛋白含量與結締組織強度密切相關[5-6]，肌肉結締組織中的膠原蛋白含量越高，肉的嫩度越低[7-8]。由于紅鰭東方鲀的肌肉組織呈現很緊密的肌膜結締組織分布，且魚肉的膠原蛋白含量比普通魚肉高得多，導致其有獨特的質地和口感[9]，因此有必要對其進行嫩化處理。

目前嫩化的方式較多，如酶處理、復合磷酸鹽處理、超聲波處理以及熱處理等。熱處理不僅可以降低肉類食品中微生物數量，抑制微生物生長，同時還可以賦予食品特定的風味、口感、色澤以及質構[10]，改善肉的嫩度。這些變化主要是在加熱過程中魚肉蛋白質發生變性和聚焦所導致的[11]。魚肉在熱處理過程中會發生一系列生化反應，如熱降解、脂質氧化、蛋白氧化等，從而引起蛋白質理化特性以及質構的變化[12]。齊海萍等[13]發現，鯉魚經30 ℃熱處理后，質構特性較好，蛋白質降解適中，能夠較好地保持魚肉原本的營養以及固有的風味。桂萍等[14]研究發現，加熱對鰱魚和雞胸混合肉的肌原纖維蛋白的影響很顯著。鄧麗等[15]通過熱處理發現，適宜的熱處理可以賦予鮑魚良好的質地和口感。JOUNG等[16]研究發現不同的真空低溫條件對肉類產品理化性質的影響很顯著，且65 ℃加熱45 min時肉類產品的品質最佳。加熱處理對魚肉中的肌原纖維蛋白以及結締組織蛋白有顯著的影響，從而改變肉的嫩度，增加魚肉的口感[17]。

本研究以冷凍河豚魚為原料，為了提高河豚魚肉在生產加工過程中的嫩度，用不同加熱溫度對其進行預處理，以河豚魚肉的剪切力為主要指標，結合魚肉的差示掃描量熱(differential scanning calorimetry，DSC)、持水性、蒸煮損失率、質構特性、流變、掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)等，研究不同加熱溫度對冷凍河豚魚肉加工特性的影響，旨在選出具有最佳嫩化效果的處理溫度，從而提高河豚魚肉調理食品的口感和嫩度，為冷凍河豚魚肉的加工和產品的開發利用提供理論參考。

1 材料方法

1.1 材料與儀器

材料：河豚魚，主要分布于北太平洋西部，在中國各大海域都有捕獲，每年3～5月份為河豚魚產卵季節，也是河豚魚最肥美的時候，本研究所用河豚魚為紅鰭東方鲀(捕撈于黃海)，屬于養殖紅鰭東方鲀，長約35 cm，重約500 g，為脫毒宰殺，去除不可食用部位，購于大連富谷食品有限公司(-90 ℃超低溫液氮速凍保藏)，全程冷鏈由貨車運回實驗室，在-18 ℃下凍藏1周后用于實驗。

試劑：戊二醛(電鏡專用)，北京寶希迪有限公司；無水乙醇，大連博諾有限公司。

儀器設備：差示掃描量熱儀(μ-DSC)，法國塞塔拉姆儀器公司；HITACHI CF 16RXⅡ離心機，Hitachi koki有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；Stable Micro Systems TA.XT.plus型質構儀，英國SMS；Discovery HR-1旋轉流變儀，美國TA儀器；S8020掃描電鏡，日本Hitachi High-technologies公司；200型電子天平，美國雙杰兄弟有限公司；DD-8 m2冷風機，大華制冷設備有限公司；BD-228 WL冰箱，青島海爾特種冰柜有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

將河豚魚自然解凍后，沿側線取魚背肉，順著肌纖維將魚背肉切成長、寬、厚約為2 cm×2 cm×2 cm大小的魚塊，分別經50、60、75 ℃加熱30 min后裝入蒸煮袋，并同時將未加熱的魚肉一同裝入蒸煮袋，真空封口，-40 ℃速凍40 min后置于-18 ℃冰箱中保存，用于測定持水率、蒸煮損失率、全質構、流變以及剪切力等指標。

1.2.2 DSC的測定

取10 mg魚肉于樣品盒中密封，然后將樣品盒放入差示掃描量熱儀樣品池中，同時打開差示掃描量熱儀，在20 ℃下平衡2 min，從20 ℃以5 ℃/min的速度升高到100 ℃，觀察DSC掃描圖譜[18]。

1.2.3 持水力的測定

參考朱瑞麒[19]方法，稱取相同質量的河豚魚肉并用脫脂棉干燥到恒重然后放入離心管中，在4 000 r/min，10 ℃條件下離心15 min，稱其質量m1。每組樣品測定4次，取平均值，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：WHC，持水率，%；m0，河豚魚肉的原始質量，g；m1，河豚魚肉離心后的質量，g。

1.2.4 蒸煮損失率的測定

將河豚魚樣品放入蒸煮袋中，在85 ℃水浴鍋中蒸煮15 min。然后用流水冷卻到室溫，再用濾紙將河豚魚肉表面的水分吸干，稱其質量為m2。每組樣品測定4次，取平均值[20]。計算如公式(2)所示：

(2)

式中：CL，蒸煮損失率，%；m0，河豚魚肉的原始質量，g；m2，河豚魚肉蒸煮后的質量，g。

1.2.5 全質構分析

取河豚魚魚塊，采用TA.XTPlus物性分析儀，利用平底柱頭P50(直徑50 mm)對河豚魚肉進行2次TPA模式壓縮測試，測試條件為：測試前速度為2 mm/s，測試速度為1 mm/s，測試后速度為5 mm/s，壓縮程度是30%，停留間隔時間為5 s，負重探頭類型為Auto-5 g，數據收集率是200 pps。每個樣品測定6次，取平均值[21]。

1.2.6 嫩度的測定

采用TA-XT plus質構儀來測定河豚魚肉剪切力。探頭型號是BSK，測試模式是hot dog，測試前速率為2.0 mm/s，測試后速率為10.0 mm/s，下行距離為20 mm，樣品厚度為10 mm。每個樣品測定6次，取平均值[22]。

1.2.7 流變分析

利用旋轉流變儀Discovery HR-1來進行分析，將河豚魚樣品均勻地分布在流變儀的下平板上，上平板降至2 mm，同時用刮板除去多余樣品。采用頻率掃描模式進行分析，頻率從0 Hz升至65 Hz，以0.6 Pa為控制最大感應力，觀察樣品的彈性模量(G′)和黏性模量(G″)[23]，分析樣品的黏彈性。

1.2.8 SEM分析

通過冷場發射掃描電子顯微鏡來測定河豚魚肉的微觀結構，將河豚魚肉縱切成3 mm左右的小塊，密封放入小試管中，加入體積分數2.5 %戊二醛溶液(電鏡專用)，使之浸過樣品，之后置于4 ℃冰箱中浸泡48 h，然后利用清水沖洗3次，再分別用不同體積分數的乙醇進行梯度脫水(10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%)，每個體積分數的乙醇脫水15 min，最后使用無水乙醇浸泡30 min。用CO2臨界點干燥儀進行置換，使用掃描電鏡觀察[24]。

1.2.9 數據處理及統計分析

采用Microsoft Excel 2010進行實驗數據統計分析。數據結果為均值±標準差(Mean±SD)，采用SPSS 22.0軟件(IBM公司)進行顯著性分析(P<0.05表示具有顯著性差異)。采用Origin Pro 8.5軟件(Origin Lab公司)進行作圖。

2 結果和分析

2.1 不同熱處理溫度的河豚魚肉DSC

圖1為河豚魚DSC掃描圖譜，隨加熱溫度的升高，DSC掃描圖譜中熱吸收峰逐漸減少，表明河豚魚肉中未變性蛋白逐漸減少。未經熱處理的河豚魚肉的DSC曲線出現2個吸收峰，分別在52.35和73.97 ℃左右。當魚肉中心溫度達到50和60 ℃時，DSC曲線上只剩下1個吸收峰，表明變性溫度在50 ℃左右時蛋白已變性，繼續加熱到75 ℃時，DSC曲線完全沒有吸收峰，表明此溫度下的蛋白已經完全變性。綜上分析可知，當加熱溫度達到75 ℃以上，基本可以使河豚魚魚肉中所有蛋白質受熱變性[18]。48 ℃左右一般為肌球蛋白變性溫度，60 ℃左右一般為肌漿蛋白變性溫度，而65 ℃是膠原蛋白的中間變性溫度，也就是說在65 ℃之前膠原蛋白開始變性，到65 ℃時并沒有完全變性[25]，PALKA 等[26]通過掃描電子顯微鏡觀察牛肉半膜肌發現，結締組織在50 ℃時并沒有變化，在60 ℃時可觀察到肌束膜和肌內膜顆?；?，70 ℃時顆?；F象增加，說明溫度從60 ℃升到70 ℃時，越來越多的膠原蛋白發生變性。付湘晉[27]經DSC分析得知，白鰱魚肌肉中的蛋白變性溫度分別為40.7、58.8和81.1 ℃，其分別對應了肌球蛋白、肌漿蛋白和肌動蛋白的變性，紅鰭東方鲀含有蛋白質種類較多，但主要為肌球蛋白和肌動蛋白[28]，因此未經熱處理的魚肉DSC曲線上出現的2個熱吸收峰溫度很可能是紅鰭東方鲀中肌球蛋白和肌動蛋白的變性溫度。

圖1 不同熱處理溫度的河豚魚DSCFig.1 DSC of puffer fish at different heat treatment temperatures

2.2 不同熱處理溫度的河豚魚肉的蒸煮損失率和持水性

蒸煮損失是衡量肉品質的一個重要指標。圖2為不同溫度下河豚魚蒸煮損失的結果。經不同溫度處理后河豚魚肉蒸煮損失率逐漸增大(P<0.05)。未經熱處理的河豚魚肉蒸煮損失率為32.5%，經50、60、75 ℃處理的魚肉與未經熱處理的魚肉相比，蒸煮損失率分別增加了5.83%、9.33%、12.42%。這可能是由于隨著溫度的升高，魚肉肌原纖維蛋白不斷發生著變性以及脂肪氧化反應，膠原蛋白析出，從而導致魚肉組織分散，空間結構不斷被破壞，汁液流失逐漸增大，魚肉的保水能力不斷降低[29]，表現為蒸煮損失率隨溫度升高而不斷上升。魚肉中心溫度越高，空間結構被破壞的越厲害，肌纖維收縮程度越大，蒸煮損失越大[30]。此外，加熱過程中蛋白疏水基團的暴露使其對水分的親和力下降，也會使蒸煮損失增加[31]。加熱溫度較低時，魚肉中的水分流失較少，蒸煮損失變化相對較小，而加熱溫度達到75 ℃時魚肉中結合力較弱的水分基本完全排出[29]，肌原纖維蛋白基本完全變性，蒸煮損失達到最高。

圖2 不同熱處理溫度的河豚魚肉的蒸煮損失率Fig.2 Cooking loss rates of puffer fish meat at different heat treatment temperatures

由圖3可知，對照組的河豚魚肉持水率最高，達到了92.38%，經50 ℃處理后，持水率下降為86.03%，而經60 ℃處理后持水率又稍有上升，為89.49%，經75 ℃處理持水率基本與50 ℃持平，但總體來說，加熱處理均比對照組的持水率低，這可能是由于50 ℃左右為蛋白質變性溫度，因此蛋白質結構受熱被破壞，導致肌球蛋白變性，肌原纖維收縮，維持蛋白質二級結構的化學鍵受到影響，組織毛細管力以及表面張力發生改變，使得毛細管中以及肌肉組織中的吸附水與一些結合水被釋放出來，致使肌原纖維結構變得更加松散，導致持水率下降。因為75與50 ℃一樣，同為變性溫度，此時的蛋白質已經完全變性。而60 ℃處理組的持水率比50 和75 ℃要高，推測可能是加熱到60 ℃時，由于熱誘導凝膠形成過程中肌原纖維蛋白中的肌球蛋白發生聚集、變性，互相交聯，從而形成致密而有序的三維網絡結構，此結構依靠毛細管力將水保留在凝膠網孔中，使保水能力上升[32]。

圖3 不同熱處理溫度的河豚魚肉的持水率Fig.3 Water holding capacity of puffer fish meat at different heat treatment temperatures

2.3 不同熱處理溫度的河豚魚肉的流變特性

流變學以彈性力學和流體力學為基礎，主要運用線性黏彈性理論，研究食品在很小的變形范圍內的黏彈性以及變化規律，是肌原纖維蛋白凝膠特性的重要指標[33]。彈性模量G′代表了樣品的彈性特征，而黏性模量G″則代表了樣品的黏性特征。由于加熱之后河豚魚的膠原蛋白會流失，導致其黏彈性發生變化，影響魚肉的品質，進而可能會影響魚肉的嫩度，通過流變儀來分析不同溫度下河豚魚的黏彈性變化趨勢，在保證魚肉有較好的黏彈性下挑選出合適的加熱溫度，有利于后續改善河豚魚的生產加工。由圖4可知，未經熱處理魚肉和所有熱處理魚肉的G′大于G″，河豚魚肉以彈性為主導，彈性特性強于黏性特性，流動性較弱。G′、G″越大，說明魚肉凝膠性越好。隨著掃描頻率的不斷增大，所有熱處理魚肉的G′和G″都高于未熱處理的魚肉，而隨著加熱溫度的升高，魚肉的G′和G″都呈現出逐漸下降的趨勢。經50 ℃處理的魚肉G′最大，其凝膠性最好，可能在此溫度下蛋白質受熱分解較少，肌原纖維較緊密，凝膠性很好，加熱到60 和75 ℃后，其蛋白質受熱分解更加劇烈，尤其是膠原蛋白，導致結構變得很松散，G′逐漸降低，凝膠性變差。60 ℃處理的魚肉G′比未經熱處理的魚肉高，比50 ℃處理的魚肉低，但也保持著比較好的凝膠性，這可能與上述所說的60 ℃下由于熱誘導形成了致密的三維網狀結構有關。G″隨溫度升高也呈現出逐漸下降的趨勢，但是經熱處理的魚肉都比未經熱處理的魚肉要高，說明隨溫度的升高，樣品的黏性也越來越大，這可能是由于溫度升高，魚肉蛋白析出導致黏性變大[34]。

圖4 不同熱處理溫度的河豚魚肉的黏彈性Fig.4 Viscoelasticity of puffer fish meat at different heat treatment temperatures

2.4 不同熱處理溫度的河豚魚肉的質構特性

硬度表現為樣品受到外力而達到一定形變后人體對其的觸覺柔軟或者堅硬。由圖5-a可知，隨加熱溫度升高，河豚魚肉的硬度發生顯著變化(P<0.05)。隨溫度升高，魚肉的硬度逐漸增大，經50、60、75 ℃處理后的魚肉硬度與對照組相比分別增加了338.71、716.96、829.09 g，這可能是由于加熱到50 ℃時肌原纖維開始逐漸變性，變得凝固收縮，進而使單位面積內的肌原纖維數量增加，對剪切力的抵抗變強，溫度越高，肌纖維蛋白的增韌作用越強，因此硬度增加[35]。DAVEY等[36]發現，結締組織的變性可導致肉在65～80 ℃變硬。KOPP等[37]發現，肌內的結締組織在溫度65 ℃以上快速加熱時會發生劇烈收縮，從而使肉質變硬。因此推測60 ℃以上肉質變硬是由于膠原蛋白收縮使肌纖維空隙減小造成的。

咀嚼性是比較全面的綜合質地分析參數，它是魚肉硬度、彈性以及凝聚力綜合作用的結果。由圖5-b可見，咀嚼性總體上呈現出先上升后下降的趨勢(P<0.05)。熱處理組魚肉的咀嚼度比對照組要高，熱處理溫度為60 ℃時，魚肉具有最好的咀嚼度，這可能是因為本來折疊著的肌原纖維蛋白分子的側鏈受熱斷裂而展開，隨后在蛋白分子之間產生更堅固的側鏈結合，并且進一步凝集，從而增大了魚肉的咀嚼性[38]。而50 與75 ℃處于蛋白變性溫度范圍，蛋白結構被破壞，導致魚肉組織結構較松散，其咀嚼性要低于60 ℃處理的魚肉。

由圖5-c和圖5-d可知，隨熱處理溫度的升高，魚肉的黏聚性和回復性都比對照組高(P<0.05)。當熱處理溫度是50和60 ℃時，魚肉的黏聚性和回復性都有不同程度地升高，這可能是由于肌動球蛋白變性所導致的，當熱處理溫度為75 ℃時，黏聚性和回復性均下降，可能是由于肌纖維收縮進一步加劇，魚肉汁液流失增加，水分含量下降所致。

膠著度是指探頭下壓一次后從樣品拔出來所需要的能量，它反映了魚肉細胞分子間的結合力大小，結合力越大，膠著度越小。從圖5-e可以看出，隨熱處理溫度的升高，魚肉的膠著度呈上升趨勢，這可能是因為隨著熱處理溫度的升高，蛋白質不斷發生變性，魚肉組織結構被破壞，結合力下降，導致膠著度不斷上升。當溫度達到75 ℃時，膠著度變化并不明顯，可能是由于此熱處理溫度下的魚肉蛋白質已經完全變性所致。膠著度如果過大，會影響魚肉的口感，因此要保證加熱溫度使魚肉膠著度稍有上升的情況下還不會使魚肉品質下降。綜合以上全質構數據分析，加熱對河豚魚的硬度、咀嚼性、黏聚性、回復性以及膠著度都有不同程度地改善，再結合持水以及蒸煮損失的結果，50 ℃為比較適宜的加熱溫度。

a-硬度；b-咀嚼度；c-黏聚性；d-回復性；e-膠著度圖5 不同熱處理溫度的河豚魚肉的質構特性Fig.5 TPA of puffer fish meat at different heat treatment temperatures

2.5 不同熱處理溫度的河豚魚肉的嫩度

剪切力對衡量魚肉嫩度有很重要的作用，剪切力越小，肉越嫩。圖6為河豚魚肉在不同熱處理溫度下的剪切力結果，經熱處理后的魚肉剪切力明顯比未處理的魚肉低(P<0.05)，尤其是75 ℃處理的魚肉其剪切力最低。肌內結締組織是肌肉組織重要組成部分，在很大程度上影響了肉的嫩度，而其中肌束膜和肌內膜中膠原蛋白的變化起關鍵作用[39]。50 ℃時，由于膠原蛋白的收縮和變性導致剪切力下降，60 ℃時剪切力上升，加熱到75 ℃時，由于膠原蛋白的分解導致肌內膜和肌束膜發生改變，從而使分子鏈上較弱的鍵斷裂，蛋白質完全變性，導致結構松散，表現為剪切力下降。同為變性溫度的50 ℃處理組比75 ℃處理組剪切力要高，可能是因為在此變性溫度下蛋白質并沒有處于完全變性的狀態，從而導致魚肉的肌原纖維未被完全破壞[40]。

圖6 不同熱處理溫度的河豚魚肉的剪切力Fig.6 Shearing forces of puffer fish at different heat treatment temperatures

臧大存等[41]研究發現鴨肉在加熱過程中剪切力值不斷升高，到60 ℃達到峰值，隨著溫度的繼續升高剪切力值開始不斷下降，這也與本文60 ℃時剪切力上升，到75 ℃時下降保持一致?？傮w來說，經熱處理后的魚肉嫩度與對照組相比都有不同程度地增加，達到了較理想的嫩化效果。

2.6 不同熱處理溫度的河豚魚肉的組織結構

由圖7可以看出，隨加熱溫度上升，肌原纖維變得收縮，表現為組織結構由松散逐漸變得致密，單位體積內的次級肌束數量變多，肌纖維間的空隙越來越小。這主要是由于蛋白質受熱變性導致肌束膜收縮，水分含量減少，肌束間的空間減小[42]。對照組的河豚魚肉肌肉纖維排列很緊密，肌原纖維基本沒有發生明顯變化，當加熱到50 ℃時，魚肉的肌原纖維開始發生斷裂，蛋白開始交聯，肌內膜和肌束膜受到破壞，逐漸溶解，這可能是由于魚肉受熱后，魚肉的肌球蛋白發生變性，導致其結構變的松散，溫度升高到60 ℃時，由于膠原蛋白受熱逐漸溶解，使魚肉結構進一步被破壞，肌原纖維收縮更加劇烈，當溫度達到75 ℃時，肌纖維直徑變小，肌肉纖維受熱收縮比60 ℃更加明顯，這是因為溫度達到75 ℃時，魚肉中的肌球蛋白、肌動蛋白和膠原蛋白全部發生變性，導致肌原纖維蛋白受熱已經完全變性[43]。

a-對照；b-50 ℃處理；c-60 ℃處理；d-75 ℃處理圖7 不同熱處理溫度的河豚魚肉的微觀組織結構Fig.7 Microstructure of puffer fish meat at different heat treatment temperatures

3 結論

不同加熱溫度可以顯著提高河豚魚的嫩度，表現為所有加熱處理的河豚魚剪切力都有明顯的降低。DSC掃描圖譜顯示未經熱處理河豚魚肉在52和73 ℃左右出現2個熱吸收峰，即出現2個變性溫度，表明此時蛋白受熱變性，由全質構分析可知，熱處理魚肉的硬度整體都高于對照組，硬度隨溫度升高逐漸增大，整體來說魚肉的咀嚼性、黏聚性、回復性和膠著度都比對照組要高，通過SEM觀察發現，溫度升高會使魚肉組織變得松散，肌纖維結構斷裂，溫度過高會使肌纖維交聯。綜合以上分析可知，50 ℃處理下的河豚魚嫩度有明顯提高且能保持較好的口感。對于河豚魚的嫩化處理還有待于進一步研究，以便提高河豚魚的品質，改善口感，開發更多的河豚魚產品。