紅曲霉與乳酸菌混合發酵藜麥制備降壓肽

王姣琳，岳田利，袁亞宏

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌，712100)

人體內對血壓調節起主要作用的是腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統，這兩套系統的調節效果正好相反，但發揮作用靠的都是一種重要的蛋白酶。在腎素-血管緊張素系統中血管緊張素I在血管緊張素轉化酶(angiotensin-I converting enzyme，ACE)的催化作用下轉化為血管緊張素II，其可使血管收縮最終導致血壓升高，同時在激肽釋放酶-激肽系統中ACE會催化舒緩激肽變為失活片段使其無法發揮舒張血管的作用，在雙重作用下導致血壓升高[1]。因此需要一種能夠與ACE結合的物質，使之無法發揮催化作用，從而達到降壓效果。市面上的降壓藥物，以人工合成的居多，高血壓人群一般需要長期服用，會導致一系列負面影響[2]。目前食源性降壓肽的研究成為熱點，例如海洋水產源、乳蛋白源、植物蛋白源等，因具有易吸收、安全性高、副作用小等優勢，有望成為大規模工業化生產的原料。

藜麥是一種起源于南美洲的古老作物，是優質的植物蛋白資源，氨基酸組成平衡且不含麩質[3]。藜麥蛋白是潛在的生物活性肽來源，可以對ACE產生抑制活性。ALUKO等[4]以堿性蛋白酶水解藜麥蛋白后發現，低分子質量(<5 kDa)的肽比高分子質量(>5 kDa)的肽具有更好的ACE抑制活性，RAVISANKAR等[5]的研究表明，藜麥源生物活性肽能夠跨越Caco-2細胞屏障從而對ACE活性有一定的抑制作用。

制備ACE抑制肽主要有酶解法和微生物發酵法，比較而言，微生物發酵法產降壓肽工藝簡單、生產效率高、價格低廉，更容易實現工業化大規模生產[2]。目前常用菌種有枯草芽胞桿菌[6]、乳酸菌[7]、曲霉菌[8]等。而復合菌種發酵相比于單菌發酵，微生物可以產生廣譜的蛋白酶，對蛋白的切割位點多，通過酶解可以將大分子蛋白質分解為高濃度的具有特定功能的小分子活性肽，酶解效率高。此外，菌體在發酵過程中的代謝產物會進一步修飾某些功能基團，提高所得肽的生物活性[9]。

本研究以藜麥為原料，通過紅曲霉與乳酸菌混合菌種發酵，制備ACE抑制肽，并通過透析、葡聚糖凝膠過濾和反相高效液相色譜(reversed phase-HPLC，RP-HPLC)3步純化發酵上清液，進行成分鑒定和性質研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗材料

藜麥(按GB 5009.5—2016測得蛋白質含量為12.096 g/100 g)，北京農品堂食品有限公司；10份紅曲樣品，福建古田、浙江溫州等地。

植物基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；ACE(來自兔肺)、N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine(FAPGG)、N-(2-hydroxyethyl)-N-(3-sulfopropyl)-piperazine(HEPES)，美國Sigma公司；葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶，上海源葉生物科技公司；透析袋，美國Viskase公司。

1.1.2 實驗菌種

紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)40268、安卡紅曲霉(Monascusanka)40704、叢毛紅曲霉(Monascuspilosus)40710、紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)41601、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)21805、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)21828、植物乳桿菌植物亞種22160(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)、腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)22184、類植物乳桿菌(Lactobacillusparaplantarum)22192、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)22227、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)23185、類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)6232，中國工業微生物菌種保藏管理中心；保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)6063和6064，本實驗室分離保存。

1.1.3 儀器與設備

TS-100B恒溫搖床培養箱，上海善志儀器設備有限公司；LC-LX-HL210D高速冷凍離心機，上海力辰儀器科技有限公司；VICTOR Nivo多功能酶標儀，珀金埃爾默儀器有限公司；T100 PCR儀，美國Bio-Rad公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，山東博科科學儀器有限公司；LC-2030 PLUS高效液相色譜儀，日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養

稱取從福建古田等地購買的10份紅曲樣品各5 g，分別加入95 mL無菌生理鹽水充分振蕩，涂布后在28 ℃培養箱中培養5 d，用無菌接種環刮下具有紅曲霉基本特征的單個菌落表面的菌絲，轉接至新的平板，反復幾次直至菌株較為純凈。

利用植物基因組提取試劑盒提取紅曲霉DNA，以提取菌落的總DNA為模板，利用真菌轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)通用引物(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進行PCR擴增。PCR擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得的序列信息利用基本局部比對搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)在GenBank核酸數據庫中進行相似性比對。

1.2.2 菌株篩選

1.2.2.1 發酵過程

清洗藜麥種子，在蒸餾水中浸泡2 h，不斷用蒸餾水沖洗直至洗滌液無泡沫，以除去皂苷并簡化發芽過程。將漂洗后的谷物撒在發芽室中室溫下發芽24 h，用高速粉碎機磨成粉末[10]。

將活化好的乳酸菌離心(4 ℃下7 500 r/min，10 min)后保留菌體，用無菌25%的林格氏液洗滌，離心(4 ℃下12 000 r/min，15 min)后用蒸餾水重懸，將細胞數量調整為6 lg CFU/mL(λ=600 nm，OD=1)。紅曲霉活化好后用無菌接種環刮取孢子放入無菌蒸餾水中，充分分散后調整孢子濃度為106～107個/mL。

稱取2 g藜麥粉放入250 mL錐形瓶中并加入80 mL蒸餾水后充分混勻，121 ℃滅菌20 min，冷卻到室溫后按照1%的接種量吸取乳酸菌懸浮液和紅曲霉孢子懸液放入錐形瓶中并分別在37和28 ℃的搖床中振蕩培養48和120 h，將發酵液在4 ℃、8 000 r/min離心8 min，收集上清液備用。根據以下指標篩選并綜合分析得到最優菌種組合。

按照福林酚法[11]測定蛋白酶酶活力。利用發酵上清液中的蛋白酶在一定的溫度與pH條件下可以水解酪蛋白底物，產生含有酚基的氨基酸，其在堿性條件下可將福林酚試劑還原，生成鉬藍與鎢藍，用分光光度法測定，計算其酶活力：1 mL酶液每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位(U/mL)?？瞻讓嶒炛杏棉见湹鞍讘腋∫禾娲鷺悠?，下同。

采用甲醛滴定法[12]測定蛋白水解度。取適量發酵上清液，加入60 mL去CO2蒸餾水，用精密pH計調節pH值為8.20，加入20 mL pH為8.20的甲醛，然后用0.100 0 mol/L的標準NaOH溶液滴定pH到9.20，記錄消耗的NaOH體積，記錄空白實驗消耗的NaOH體積，—NH2含量和蛋白水解度分別按公式(1)(2)計算：

DH/%=h/htot×100

(1)

(2)

式中：h，水解后每克蛋白被裂解的肽鍵數；htot，每克蛋白質中肽鍵數，一般來說，htot是一個常數，經過計算，藜麥蛋白的htot為7.2 mmol/L；c(-NH2),-NH2含量,mol/L；c(N)，N含量，mol/L。

采用比色法[13]測定粗多肽得率。取2.5 mL發酵上清液，加入等體積0.1 g/mL的三氯乙酸靜置30 min，在4 ℃、5 000 r/min離心20 min，取2 mL上清液，加入8 mL雙縮脲試劑，在25 ℃下靜置30 min，測540 nm處的OD值。對照酪蛋白標準曲線求得樣品溶液中的多肽含量。粗多肽得率按公式(3)計算：

(3)

式中：ρ(多肽)，樣品溶液中的多肽質量濃度，mg/mL；V，樣品總體積,mL；m，樣品質量，mg。

1.2.2.2 混菌驗證實驗

將最優菌種組合按發酵步驟共同加入發酵底物中，在33 ℃的搖床中振蕩培養84 h，將發酵液在4 ℃、8 000 r/min離心8 min，保留上清液按照上述方法測定蛋白酶酶活力、蛋白水解度和粗多肽得率，按照劉子毅[14]的方法測定ACE抑制率。

1.2.3 ACE抑制肽的工藝條件優化

選取菌種比例[m(戊糖片球菌22227)∶m(紫色紅曲霉4422)分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3]、培養時間(48、72、96、120、144 h)、培養溫度(28、31、34、37 ℃)3個因素進行單因素試驗，料液比為1∶40(g∶mL)，接種量為1%，離心后收集上清液，分別測定ACE抑制活性。

1.2.4 ACE抑制肽的分離純化

1.2.4.1 透析

準備3種規格的透析袋，截留分子質量分別為1 k、6 k和10 kDa，獲得了MWs<1 k、1 k～6 k、6 k～10 k和> 10 kDa的4個組分，調整至相同蛋白濃度，分別測定ACE抑制率，下同。

1.2.4.2 凝膠過濾色譜

葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25使用前填料必須充分溶脹，平衡好基線，樣品過濾后(0.45 μm)上樣，用自動收集器每隔3 min收集1管，在220 nm處測定各管的吸光度值，以管數為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制洗脫曲線，測定各峰處的ACE抑制率[15]。

1.2.4.3 RP-HPLC

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(4.6 mm×250 mm，5 μm)，洗脫條件為流動相A乙腈，B含0.1%三氟乙酸的超純水，等度洗脫：0～15 min，55%A+45%B。檢測波長280 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，流速0.6 mL/min，自動進樣，手動收集各峰處的液體，測定ACE抑制率[16]。

1.2.5 ACE抑制肽的成分鑒定和性質研究

1.2.5.1 氨基酸組成分析[17]

配制一系列濃度的氨基酸標準溶液，利用高效液相色譜測定氨基酸組成。條件如下：色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；檢測波長254 nm。

1.2.5.2 熱穩定性、pH穩定性和酶學穩定性研究

取分離純化后的樣品，分別置于4、37、60、80 ℃的水浴中，在0、0.5、1.0、2.0、3.0 h取出后迅速冷卻，檢測其ACE抑制活性。

取分離純化后的樣品，分別調pH值為2、5、7、10，40 ℃水浴0、0.5、1.0、2.0、3.0 h取出，適應室溫后，將pH調節至8.3，檢測其ACE抑制活性[18]。

取分離純化后的樣品，將其pH值調節至2.0后加入胃蛋白酶，在37 ℃下孵育2 h，然后將酶解溶液的pH調節至7.0，再加入胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶，在37 ℃下孵育4 h后，沸水浴10 min滅酶活力，檢測其ACE抑制活性。

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶菌種及混菌發酵制備ACE抑制肽菌種的篩選

紅曲樣品種類及來源見表1。

表1 紅曲樣品來源Table 1 The source of monascus sample

通過菌株分離純培養，從紅曲樣品共得到29株疑似菌株，從形態學和分子生物學方面對疑似菌株進行鑒定[19]。在形態學上有6株分離菌株的各項特征與紫色紅曲霉一致，PCR擴增產物凝膠電泳表明6株分離菌1316、4422、4424、7324、7413和7414在500 bp位置附近都出現寬亮條帶，序列信息經過BLAST比對，表明該菌屬于紅曲霉屬。根據同源性比對的結果，利用Mega 6.0軟件構建系統發育樹，結果如圖1所示。通過系統發育樹可以看出6株分離菌與紫色紅曲霉MonascuspurpureusJN121729.1的同源性最高，達到99%以上，可初步將6株分離菌株歸類為紅曲霉屬，但是無法確定分離菌株具體為哪一種菌。

圖1 以ITS序列同源性為基礎的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS sequence homology

經7 d的培養后測得紅曲霉4422、7413、40268、41601蛋白酶酶活力較高，最高值達到95.12 U/mL；41601、7413、40268、1316、4422對藜麥蛋白的水解度較高，最高值達到37.38%；粗多肽得率沒有顯著差異，其中40710、4422、7414、40704的粗多肽得率略高，最高值達到4.71%。乳酸菌經48 h的培養后，22192、6064、6063、22227蛋白酶酶活力較高，最高值達到了221.98 U/mL；6063、22184、22160、22192、22227對藜麥蛋白的水解度較高，最高值達到8.49%；22160、22192、21828、6064、22227的粗多肽得率較高，最高值達到28.67%；這表明菌種在代謝期間可以產生酶活力較高的蛋白酶，不同的蛋白酶作用于不同的切割位點，有利于大分子底物蛋白被切割成小分子肽段，從而產生生物活性肽。研究表明[20]許多蛋白質長鏈可能不顯示生物活性，但被酶解后產物中的小分子肽會顯示多種活性功能。生物活性肽的分子質量大小、肽鏈長度以及組成結構都會對其功能特性及生理活性產生影響。而粗多肽得率反映了菌種發酵底物蛋白過后所得的小分子肽的含量即發酵的反應程度。

綜合分析蛋白酶酶活力、水解度和粗多肽得率3個因素，最終選擇保加利亞乳桿菌6063、戊糖片球菌22227、類植物乳桿菌22192，紫色紅曲霉7413、4422、41601、40268進行混菌發酵驗證實驗。

如圖2所示，通過混菌驗證試驗發現，以ACE抑制率(圖2-d)為主要指標，蛋白酶酶活力(圖2-a)、蛋白水解度(圖2-b)和粗多肽得率(圖2-c)為次要指標進行分析，戊糖片球菌22227和紫色紅曲霉4422混合發酵的效果最好，ACE抑制率最高，達到84.21%，雖然蛋白酶酶活力低于其他菌種組合，蛋白水解度和粗多肽得率較高。

a-蛋白酶酶活力；b-蛋白水解度；c-粗多肽得率；d-ACE抑制率 1-6063+7413；2-6063+4422；3-6063+41601；4-6063+40268;5-22227+7413；6-22227+41601；7-22227+4422；8-22227+40268; 9-22192+4422；10-22192+41601；11-22192+7413；12-22192+40268圖2 混菌驗證發酵結果Fig.2 The results by fermentation with mixed bacteria

由圖3可知與混菌發酵相比，單菌發酵后的蛋白酶酶活力、粗多肽得率和ACE抑制率都顯著降低(P<0.01)，紅曲霉4422發酵上清液的蛋白水解度與混菌發酵相比僅略有降低，總體來看，混菌發酵制備ACE抑制肽的優勢程度大于單菌發酵。

圖3 單菌與混菌發酵的比較Fig.3 Comparison of single and mixed fermentation注：*，P<0.05；**，P<0.05

因此選擇戊糖片球菌22227和紫色紅曲霉4422作為混菌發酵產ACE抑制肽的優勢菌種?？赡苁且驗檗见湹牡鞍捉Y構具有優越性，經過發酵后所得肽段由于其氨基酸長度、組成和結構等原因導致更易與ACE結合，從而表現出較高的ACE抑制率。

2.2 混菌發酵制備ACE抑制肽的工藝優化

圖4呈現了菌種比例、培養時間和培養溫度對ACE抑制率影響的單因素試驗結果。分析ACE抑制率隨各個因素不同水平的變化規律，選擇培養溫度28 ℃、菌種比例2∶1、發酵時間7 d為最佳發酵條件。在此發酵條件下，ACE抑制率達到83.13%。這與利用枯草芽胞桿菌和黑曲霉復合發酵米糠制備ACE抑制肽所得的抑制率(64.48%)相比大大提高，當前制備ACE抑制肽應用最廣泛的原料是大豆蛋白，與保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)發酵大豆分離蛋白制備降壓肽所得的抑制率(57.93%)[21]相比也有了大幅提升。

a-菌種比例；b-培養時間；c-培養溫度圖4 單因素試驗結果Fig.4 Single factor experiment results

2.3 混菌發酵產ACE抑制肽的分離純化及成分鑒定

2.3.1 透析分離

在最佳發酵條件下制備的發酵上清液經透析分離得到了4個組分(F1：>10 kDa，F2：6 k～10 kDa，F3：1 k～6 kDa和F4：<1 kDa)，它們的ACE抑制率如圖5所示，其中F3組分的ACE抑制率最高測定為82.85%。

圖5 不同截留分子質量組分的ACE抑制率Fig.5 The ACE inhibition rate of different interception molecular weight components

2.3.2 葡聚糖凝膠過濾色譜分離純化

合適的洗脫液、洗脫流速和上樣量是葡聚糖凝膠過濾色譜分離純化蛋白的關鍵，經透析后的組分F3在葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25過濾層析色譜上分離得到了3個比較明顯的峰，分別標記為S1、S2和S3，其中S2峰處的吸光度值最高，收集各峰處的液體測定它們的ACE抑制率，如圖6所示，其中S2組分的ACE抑制率最高測定為86.06%。

2.3.3 RP-HPLC分離純化

組分S2經RP-HPLC分離純化后的色譜圖如圖7所示，此時的分離純化肽仍不是單一組分，圖中有3個比較明顯的峰，其中峰Ⅲ的面積較大，重復收集3個峰處的液體，分別命名為H1、H2和H3，測定它們的ACE抑制率，其中H3組分的ACE抑制率最高測定為89.75%，可以看出與純化前相比ACE抑制率得到了提升，效果良好。

2.3.4 成分鑒定

利用高效液相色譜對H3組分進行氨基酸種類和含量的測定，如表2所示，共測得12種氨基酸，包括丙氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸等疏水性氨基酸，且它們的含量達到了氨基酸總量的50%以上，降壓肽的ACE抑制活性與其結構中C末端的氨基酸種類有關，當為疏水性氨基酸時具有較高的抑制活性[22]。

a-Sephadex G-25柱層析圖譜；b-分離組分的ACE抑制率圖6 Sephadex G-25柱層析圖譜及分離組分的ACE抑制率Fig.6 Sephadex G-25 column chromatography and ACE inhibition rate of separated components

a-分離純化肽的RP-HPLC圖；b-分離組分的ACE抑制率圖7 分離純化肽的RP-HPLC及分離組分的ACE抑制率Fig.7 RP-HPLC of peptides and ACE inhibition rate of components

表2 組分H3的氨基酸組成Table 2 The amino acid composition of H3

2.4 混菌發酵產ACE抑制肽的性質研究

2.4.1 溫度對ACE抑制肽活性的影響

生物活性肽的熱穩定性非常重要，通常熱處理會引起蛋白質變性如交聯、締合和聚集。在不同溫度條件下所制備的降壓肽對ACE的抑制效果是不同的。如圖8所示，在4和37 ℃時，所制備降壓肽的ACE抑制活性穩定，孵育3 h后ACE抑制率可保留91.84%。在60 ℃時，ACE抑制肽部分逐漸失活，抑制率最終可保留75.53%。在80 ℃時，有大量降壓肽失去與ACE結合的能力，抑制率最終僅保留48.88%，這是因為ACE抑制肽在高溫條件下的裂解速度會加快，超過60 ℃可能會影響肽的二級結構。所制備的ACE抑制肽在低溫條件下，可以保持較好的活性，而當溫度過高時其活性會大幅降低。蠶蛹源ACE抑制肽熱穩定性的研究也得出了相似的結論[23]。

圖8 溫度對ACE抑制肽活性的影響Fig.8 Effects of temperature on activities of ACE inhibitory peptides

2.4.2 pH對ACE抑制肽活性的影響

處于不同消化階段會遇到不同pH，因此降壓肽對不同pH值的穩定性十分關鍵。人胃的pH值為2～5，物質在攝入后至少需要2 h才能完全從胃進入十二指腸，而且大腸中膽汁的pH值幾乎保持中性。pH條件會對降壓肽與ACE結合的能力產生影響，如圖9所示，在pH為5的條件下孵育3 h，所制備的降壓肽的抑制率下降最緩慢，活性可保留到原來的87.31%，在pH為2的條件下孵育效果次之，抑制率可保留75.03%，在pH為7和10的條件下活性損失較為明顯，分別僅為初始值的68.05%和44.73%。所制備的ACE抑制肽在偏酸性的條件下，可以保持較好的活性，而在強堿性條件下活性會大幅降低，穩定性差，可能由于在堿性環境下發生了水解，影響了肽的數量、大小、結構、氨基酸組成和疏水性，從而造成活性降低。

圖9 pH對ACE抑制肽活性的影響Fig.9 Effects of pH on activities of ACE inhibitory peptides

2.4.3 胃腸道蛋白酶對ACE抑制肽活性的影響

除pH值外，胰蛋白酶、胃蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等胃腸道酶也是影響肽結構和活性的主要成分。如表3所示，與對照相比，經胃蛋白酶消化后，所制備的ACE抑制肽活性顯著降低(P<0.05)，這與關于蛋清源ACE抑制肽抵抗胃腸道蛋白酶試驗結論類似[24]，活性降低可能是由于部分ACE抑制肽被胃蛋白酶水解為分子質量更小的肽段，其組成和結構發生改變，不能再與ACE作用。而經胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶連續消化后，ACE抑制率出現了輕微的上升現象，但與經胃蛋白酶消化相比影響并不顯著，可以認為與經胃蛋白酶消化相比，連續消化并不影響ACE抑制肽的活性。在米糠蛋白源ACE抑制肽的體外消化試驗中也發現了相似的現象[25]。

表3 腸道酶消化對ACE抑制肽活性的影響Table 3 Effects of intestinal enzyme degradation on activities of ACE inhibitory peptides

3 結論

本研究以藜麥為底物，利用紅曲霉與乳酸菌混合菌種發酵的方式制備了一種ACE抑制肽，前期通過對蛋白酶酶活力、蛋白水解度和粗多肽得率3個指標進行篩選，得到混菌發酵的最優組合為紫色紅曲霉4422(M.purpureus)和戊糖片球菌(P.pentosaceus)22227，所得降壓肽的ACE抑制率可達到84.21%，通過對混菌發酵過程的最佳發酵條件進行優化，得到了在培養溫度為28 ℃、P.pentosaceus22227和M.purpureus4422菌種比例為菌種比例為2∶1、發酵7 d，ACE抑制率最高，可達到83.13%，ACE抑制肽經透析、葡聚糖凝膠過濾色譜及RP-HPLC提純之后得到的肽段，ACE抑制率可達到89.75%，其中含有丙氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸等疏水性氨基酸，且占到氨基酸總量的50%以上，這些高含量的疏水性氨基酸這被認為與ACE抑制能力有關，在低溫、弱酸性情況下以及體外連續消化試驗過程中，該ACE抑制肽可保持較好的穩定性。