牛羊乳區別檢驗的PCR高分辨熔解檢測方法

賀曉玲，馬西亞，徐秦峰

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)

食品摻假是人們一直以來比較關注的問題，乳及乳制品作為一種富含營養物質的日常消費品，成為了非常容易受到摻假影響的食品[1]，在世界各國都存在摻假現象[2]。隨著人們消費觀念的提高，高品質、高營養的水牛乳和羊乳產品逐漸獲得消費者的認可[3-4]。為謀求商業利益，不法商家用牛奶代替山羊奶或者水牛奶[5-7]，進而引發經濟利益、宗教習俗、過敏等問題[8-10]。因此，亟需鑒定乳制品的乳源種類，以保護消費者免受摻假產品的侵害。

目前鑒別乳源成分的方法主要為蛋白質和DNA序列分析。相比于蛋白質，DNA由于穩定性高更適合作為各類乳制品檢測分析的目標物[11]。DNA的分析方法中，PCR因其特異性好、靈敏度高而被廣泛應用[12]。普通PCR產物分離通常需要結合RFPL[13]、電泳[14]、測序等開管檢測方法，容易產生污染。隨著科學技術的發展，實時PCR被引入鑒定乳制品的真偽。實時PCR包括探針法和染料法[15]，其中探針法價格貴且設計較為復雜，染料法雖然成本低、通用性好，但相對于探針法特異性不強。高分辨熔解曲線是一種在實時PCR擴增完成后監測擴增子熔解行為的分析方法，可以區分目標基因序列的微小差異，具有靈敏、快速、高通量的優點，常被應用在基因分型、突變掃描和甲基化檢測領域[16-19]。近年來，PCR高分辨熔解曲線(high-resolution melting, HRM)廣泛用于肉制品、海鮮、乳制品等食品的真實性鑒定和溯源分析[19-20]。在檢測乳及乳制品摻假方面，特異性引物結合PCR-HRM方法被用于區分希臘菲達奶酪中牛、山羊、綿羊3種動物源性成分[6]、鑒別水牛乳制品中的牛乳成分[21]?；谔禺愋砸锏腜CR-HRM方法在鑒別乳源成分時，需要進行復雜的引物設計，在進行多重檢測時需要添加多對引物，使得反應體系復雜、優化困難且浪費試劑。通用引物克服了特異性引物的不足，不需要復雜的引物設計及優化就能實現在同一反應體系中檢測多個目標物。本文將通用引物與HRM相結合實現對山羊、綿羊、牛、水牛4個物種的鑒別檢測，達到分析乳及乳制品中多個物種的目的，為維護消費者合法權益以及乳產品市場安全提供技術支撐。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

生牛乳、生羊乳，西安市未央區奶牛場和市場；生水牛乳和綿羊乳，淘寶網，鮮奶于-20 ℃保存備用。用于驗證特異性的非目標DNA(驢、馬、兔子、雞、鴨、鴿子、魚、豬)，四川華漢三創有限公司。不同品牌的牛、山羊、綿羊、水牛乳產品(液態乳、全脂奶粉、脫脂奶粉及配方奶粉)等樣品分別購自西安市以及網上不同的超市。

1.2 試劑與儀器

磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker，天根生化科技有限公司；通用引物，生工生物工程股份有限公司；EvaGreen，Biotium公司。MyGo Pro熒光定量PCR儀，IT-IS Life Science Ltd；MYSPIN 12微型離心機，Thermo Fisher Scientific；5424R高速冷凍離心機，Eppendorf 有限公司；Q6000超微量分光光度計，美國Quawell。

2 實驗方法

2.1 提取DNA

將購買的液態乳和固體乳粉的脂肪去除后，按照磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒操作步驟，提取所有樣品的DNA。采用超微量核酸定量儀測定DNA的濃度和純度，將DNA稀釋至20 ng/μL，放于-4 ℃冰箱備用。

2.2 設計通用引物

根據美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)所公布的GU295658(山羊)、AF010406(綿羊)、AF492351(奶牛)和NC_006295(水牛)的基因序列，通過BioEdit對比其核苷酸全序列，依據物種的保守性和特異性，按照引物設計原則進行設計，保證通用引物可同時特異性擴增4個物種，且擴增產物間的序列具有差異性，能夠通過高分辨率熔解曲線分析鑒別。

2.3 PCR-HRM反應體系建立

PCR反應體系組成為：5 μL 2×Tap PCR Master Mix，1 μL(20 ng/μL)DNA模板，0.5 μL的上游引物和下游引物，0.5 μL 20×EvaGreen染料，最后加水補充至10 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進行30個循環；72 ℃再延伸5 min，擴增完成后立即對擴增產物進行高分辨熔解程序：65～95 ℃升溫熔解，熔解梯度為0.05 ℃/s。在該溫度范圍熔解，既可以去除引物二聚體的干擾，也可以保證得到足夠有效的熔解數據進行HRM分析。擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳技術驗證片段大小。

2.4 PCR-HRM可行性和特異性驗證

將通用引物擴增的目標序列導入BioEdit對比4個物種的基因序列差異性，確認DNA序列具有可區分性。進一步將4條目標序列導入u-melt線上軟件擬合高分辨熔解曲線，分析是否可以相互區分。將從牛、水牛、綿羊、山羊乳及其制品中提取的DNA作為模板，進行PCR-高分辨熔解實驗，對比擬合曲線與實驗所得曲線，確認實驗的可行性。將購買的雞、豬、馬、兔和魚等動物的DNA稀釋至20 ng/μL分別加入PCR-HRM反應體系，觀察有無擴增曲線，取擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳實驗，確認通用引物的通用性及特異性。

2.5 PCR-HRM體系檢測多元混合物

為了進一步驗證所建立的方法的區分能力，將山羊、綿羊、牛、水牛4個物種的DNA按照排列組合方式預先混合，其中單組分4種、雙組分6種、3組分4種和4組分1種共計15種混合物，對所有DNA混合物執行相同的PCR-HRM實驗程序，考察該檢測方法對混合物的區分能力。

2.6 PCR-HRM體系檢測不同摻假比例樣品

取20 ng/μL的山羊、水牛乳DNA于離心管中，分別將不同比例的牛乳DNA與其混合，比例依次為5%、10%、50%、80%、90%，取1.0 μL上述混合DNA作為模板進行PCR擴增，以5%的摻假為方法的可應用性的限度，并以單個物種DNA來源樣本熔解曲線為參考，對不同摻假比例的樣品進行檢測，考察所建立的方法的實際應用性，以及對摻假成分的相對定量。

2.7 PCR-HRM體系檢測實際樣品

為了驗證本方法的實用性及準確性，對市售的14種乳制品分別采用PCR-HRM和sanger測序進行鑒定，確認實際應用價值。

3 結果與分析

3.1 通用引物的選取設計

經篩選得到了一對通用引物，正向引物序列為5′-TTTGGTCCCAGCCTTCCTGTT-3′，反向引物序列為5′-CTTAGTCAAACTTTCGTTT-3′。利用BioEdit軟件比對該通用引物對應的4個物種的完整擴增序列(以山羊的擴增序列為參照)。比對結果如圖1所示，圖中黑框范圍內的是通用引物的堿基序列，圓點代表4個物種之間的相同堿基，可以很明顯地看到，4個物種的堿基之間有差異，說明使用該通用引物，理論上可以區分出這4個不同的物種，其中序列差異最小的為水牛和牛，存在5%的序列差異，綿羊和奶牛的序列差異最大為13%，4個物種堿基序列平均差異約為10%。

圖1 通用引物對應的4個物種的核苷酸序列差異對比Fig.1 Sequence alignment of four species corresponding to universal primers

3.2 PCR-HRM方法可行性分析

利用u-Melt軟件(https://dna-utah.org/umelt/quartz/)擬合通用引物對應的牛、水牛、山羊、綿羊基因序列的高分辨熔解曲線，擬合結果如圖2-a所示。擬合得到4條獨立特異的熔解曲線，曲線之間可以相互區分，證明理論上可以通過高分辨熔解曲線區分4個物種(圖2-a)。進一步用提取的DNA做PCR-高分辨熔解驗證實驗，結果見圖2-b，實驗獲得的熔解曲線與理論擬合的曲線類似，其中水牛熔解曲線出現在最右端，因為其靶序列含有較高的GC，相反的，牛的靶序列GC比例最小，因此牛的熔解曲線位于最左側，通用引物對應的牛和水?；蛐蛄胁町愖钚?，但采用熔解曲線分析可以明顯區分，且區分效果較好。實驗結果表明4個物種對應的熔解曲線可以相互區分，因此驗證了該鑒定方法用于山羊、綿羊、牛、水牛4個物種鑒別分析的可行性。圖2-c中將該通用引物用于擴增其他物種以驗證特異性，4個目標物種均可以有效擴增，此外擴增曲線顯示鴿子、魚、豬的Ct在27，而BLAST結果顯示該對引物是無法擴增這3個物種，因此該擴增曲線可能由于樣本提取時受污染所致。瓊脂糖凝膠電泳圖中只有牛、水牛、山羊、綿羊有明顯條帶，且符合預期長度，證明該通用引物對牛、水牛、山羊、綿羊具有通用性和對其他物種具有特異性。

a-擬合熔解曲線；b-實驗熔解曲線；c-擴增曲線及瓊脂糖凝膠電泳圖圖2 PCR-HRM可行性驗證Fig.2 Verification of PCR-HRM feasibility注：圖c中M是marker，1～10泳道分別對應于山羊、綿羊、牛、水牛、驢、馬、兔子、雞、鴨DNA

3.3 PCR-HRM體系檢測多元混合物結果

采用通用引物擴增單組分(山羊、綿羊、牛、水牛)、二元混合物(山羊+牛、綿羊+牛、水牛+牛、山羊+水牛、山羊+綿羊、綿羊+水牛)、三元混合物(山羊+綿羊+牛、山羊+綿羊+水牛、綿羊+牛+水牛、山羊+牛+水牛)、四元混合物(山羊+綿羊+牛+水牛)，并對以上15種樣本進行高分辨熔解，熔解結果見圖3。歸一化曲線圖中大部分樣本的曲線形狀獨特，可以相互區分，有幾個樣本的曲線發生了重疊，差異性很小。根據WITTWER等[18]的研究顯示，差異化曲線的區分效果更好，分析15種不同樣本對應的差異化曲線，區分能力優于歸一化熔解曲線，與文獻報道一致。在圖3-c、圖3-d的二維和三維主成分分析圖中，同一樣本的3個平行被劃為1個聚類，含有不同物種的樣本分布在不同位置，混合物可以依據聚類位置相互區分。結果證明該方法可以對15種目標物進行鑒別，區分能力強大，適合多元混合物的摻假檢測。

3.4 PCR-HRM體系檢測不同摻假比例樣品

將山羊和牛的DNA按照不同比例混合，每個混合物做3個平行，進行PCR-HRM檢測，分析由熔解曲線得到的主成分分析(principal component analysis，PCA)，結果如圖4-a所示，每個樣本的3個平行由于主成分相同被劃為1個聚類，最左和最右邊分別是100%牛和100%山羊，隨著牛DNA在樣本中占比增加，聚類逐漸靠近100%牛，說明摻假比例和聚類在PCA圖中的PC1有一定的關系，因此以PCA圖中各聚類PC1數值的平均值為縱坐標，混合比例為橫坐標做標準曲線，線性回歸模型相關系數R2=0.995。用相同的方法做牛和水牛DNA的摻假實驗，得到相似結果，線性回歸模型相關系數R2=0.998。根據文獻報道，摻入5%的外源物即可通過摻假獲得經濟利益[22]，因此以5%為最低檢測標準，本實驗證明可以檢測到占比為5%的牛DNA，確認PCR-HRM可以實現對山羊乳DNA、水牛乳DNA中摻假牛乳DNA的相對定量。

a-歸一化熔解曲線；b-差異化熔解曲線；c-二維PCA分析圖；d-三維PCA分析圖圖3 PCR-HRM多元混合物檢測結果Fig.3 Multivariate mixtures detection results by PCR-HRM

a-山羊和牛摻比PCA圖；b-山羊和牛摻比標準曲線圖；c-水牛和牛摻比PCA圖；d-水牛和牛摻比標準曲線圖圖4 山羊、水牛和牛不同摻假比例樣品的檢測結果Fig.4 Results of pure goat and buffalo milk DNA mixed with bovine in progression proportions

3.5 市售樣品的應用性檢測

因為牛奶價格較低且含有過敏蛋白，所以采用建立的檢測方法測定了山羊和水牛乳及其制品中牛乳的摻假情況。對市售的14種乳制品進行PCR-HRM實驗，分別設置牛、山羊、水牛標準品對照，依據不同品牌乳制品在PCA圖中的聚類分布位置確認其主成分。檢測結果如表1所示，本文建立的方法一共檢測了12個主成分為牛和山羊乳的產品，其中有2個標簽標示為純山羊乳，卻檢測到牛的DNA，其余產品成分均與標簽標識成分一致。此外還對2種主成分為牛和水牛乳的產品進行檢測，結果顯示樣本13、14都含有牛和水牛2種成分，樣本13符合標簽，樣本14不符合。通過對以上14種市售乳制品的檢測鑒定，確認有3種乳制品的實測成分與標簽不符，在純山羊乳、純水牛乳制品中摻入了牛乳成分。對樣品進行Sanger測序，其中3組樣品的測序結果如圖5所示。樣品1、4、7分別為牛羊混合、純牛、純山羊，測序結果(擴增序列77～102 bp)顯示，純山羊、純牛的測序峰都是單峰，沒有雜峰出現，而牛、山羊混合的樣品測序峰比較雜亂，并且出現了重疊峰，與本文建立方法的檢測結果一致。實驗結果證明基于通用引物的PCR-HRM具有實際應用能力，可用于乳及乳制品的真實性鑒定。

表1 通用引物PCR-HRM反應體系對市售牛、 山羊、水牛乳制品的檢測應用Table 1 Application of PCR-HRM reaction system in the detection of bovine, goat, water buffalo milk products

圖5 部分市售乳制品測序結果Fig.5 Sanger sequencing results of some commercial dairy products

4 結論

本研究針對牛、水牛、山羊、綿羊的基因序列設計了一對通用引物，建立了基于通用引物的PCR-HRM檢測方法。該通用引物的PCR產物借助HRM分析可以成功區分以上4個物種，且不能擴增其他物種，具特異性。同時該方法可鑒別多元混合物，具備分析復雜、多目標樣本的能力，可以檢出摻假比例為5%的牛DNA，符合市場檢測需求。將該方法用于市售乳及其制品的鑒別，檢測結果與測序結果一致，檢測結果可靠。與普通熔解曲線相比，高分辨熔解曲線因采用飽和染料具備更高的分辨率和區分能力，在分析同源性高的牛、水牛親緣物種時，也能顯示良好的區分效果。此外，PCR-HRM方法不用開管操作，減小了檢測環境及待測樣本受PCR產物污染的可能性，并且操作簡單，經短時培訓后即可進行實驗操作和數據分析，更重要的是基于通用引物進行PCR，可在1次反應中同步檢測4個物種、檢測通量高、檢測成本低，適用于各類企業、廠家、研究所等。采用相同的方法優化篩選相應引物，所建立的方法也可用于牦牛奶、駱駝奶等高附加值乳制品的摻假分析，從而為食品中多種動物源性成分的摻假檢測提供技術支撐。