基于氣相-離子遷移色譜結合化學計量學分析大鯢肉烤制過程中揮發性風味成分

金文剛，趙萍，劉俊霞，耿敬章，陳小華，裴金金，姜鵬飛

1(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中，723001) 2(大連工業大學 食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連，116034)

大鯢作為我國特種養殖大型水生兩棲動物，具有較高的食用和藥用價值[1]。近年來，大鯢已在我國多個省市實現了規?；斯ゐB殖[2-4]。隨著大鯢養殖產業逐漸低迷，特別是新冠肺炎疫情影響下，商品鯢滯銷給養殖企業、養殖戶造成了較大經濟損失，大鯢綜合加工利用愈發成為養殖業轉型發展的瓶頸[4-5]。目前，大鯢深加工應用基礎研究逐漸增多，諸如營養評價[6]、貯藏保鮮[7]、活性成分提取[8-9]等，對延伸大鯢產業鏈具有一定推動作用。

燒烤是肉類食材比較流行的烹制方法之一，因其制作便捷、口味鮮美，特別是食材中蛋白質、糖以及調味料在高溫條件下誘發Maillard反應、酯化反應以及帶有部分煙熏味，賦予烤肉獨特的食味品質[10]，被越來越多消費者青睞。隨著食品揮發性風味物質檢測技術和方法的日益成熟，烤肉的揮發性風味物質也能得到很好的定性定量評價，例如氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、氣相色譜-嗅聞法(gas chromatography olfactory, GC-O)、電子鼻等技術已廣泛用于各種烤肉食品風味物質分析中[11-12]。與GC-MS常規揮發性成分分析相比，氣相色譜-離子遷移譜(GC-ion mobility spectroscopy，GC-IMS)是一種快速檢測揮發性風味成分的新興技術，可實時得到風味物質的構成及可視化圖譜，具有靈敏度高、檢測速度快、操作方便等優點[11,13]，在食品揮發性風味檢測領域應用范圍不斷擴大。

在熱加工肉類風味定性定量分析方面，有關GC-IMS技術的應用研究也顯示出了一定優勢。QIAN等[14]通過GC-IMS分析了腌制和油炸對紅燒鴿子風味物質的影響；CHANG等[15]利用GC-IMS技術構建了自熱油炸鲅魚風味指紋圖譜；CUI等[16]利用GC-IMS對不同烹飪加工的魷魚揮發性風味物質進行了分析；姚文生等[10]利用GC-IMS技術對市售烤羊肉串揮發性風味物質進行了分析，構建了烤羊肉串風味物質指紋圖譜；徐永霞等[11]采用GC-IMS分析了海鱸魚蒸制過程中揮發性風味物質的動態變化，表明GC-IMS結合正交偏最小二乘法可區分魚肉熟化過程。

隨著大鯢分割加工產業化，小包裝速凍大鯢肉片、肉丸等初加工產品逐漸上市，消費人群不斷擴大。前期利用GC-IMS技術對大鯢肉揮發性有機物進行了分析，發現大鯢不同部位氣味物質存在較大差異[4]。養殖大鯢由于食用魚餌料、腥味較重，限制了大眾接受度。餐飲市場只有高明廚師和部分有經驗的養殖戶才能制作出美味可口的大鯢菜品，而普通大眾無法做到。燒烤作為一種容易掌握的烹飪方式，在我國各地已形成了一種流行文化[10]，大鯢肉經腌制、高溫烤制、熟化后具有獨特的口感和風味，也受到越來越多消費者追捧。然而有關大鯢肉烤制過程中揮發性風味物質研究，未見文獻報道。為此，本研究利用GC-IMS技術結合偏最小二乘法分析確定大鯢肉烤制過程中特征揮發性風味物質的動態變化，為今后大鯢烤肉類調理食品開發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：養殖大鯢[3尾健康子二代個體，體重為(2.26±0.21)kg]，漢中市魏大鯢生態繁養園。低溫運回實驗室后宰殺、去內臟、分割獲得大鯢胴體4 ℃冷藏備用。

分析純正酮(2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮)，國藥化學試劑北京有限公司；料酒(含黃酒、香辛料、食鹽、酵母抽提物、谷氨酸鈉、5′-呈味核苷酸二鈉，酒精度≥10%vol)，山東魯花集團有限公司；生姜和食鹽，當地華潤萬家超市。

1.2 儀器與設備

K42電烤箱，廣東格蘭仕集團有限公司；Flavour Spec?風味分析儀，德國G.A.S公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同烤制時間大鯢肉樣品制備

參考丁丹等[17]和前期烤制大鯢肉的方法[18]，稍作調整。選取50個大小均勻去皮大鯢肉塊[約3 cm×2 cm×1 cm，每塊(25.67±1.46)g]→加入10 g生姜末、15 mL料酒和8 g食鹽拌勻腌制30 min→瀝干→放入電烤箱設置160 ℃→于0、20、40、60和80 min獲得不同烤制時間大鯢肉樣品，外觀如圖1所示，組織搗碎機絞碎混合均勻后，用于風味分析。

圖1 不同烤制時間大鯢肉外觀照片Fig.1 Appearance photo of giant salamander meat at different roasting time

1.3.2 大鯢肉烤制過程中揮發性風味成分分析

采用GC-IMS對不同烤制時間大鯢肉樣品揮發性有機物進行分析。分別取烤制過程中不同時間段大鯢肉樣品，精密稱取3.0 g，放入20.0 mL頂空進樣瓶中，90 ℃孵育1 min進樣后上機分析，每個肉樣測定3次，由儀器軟件獲得揮發性有機物差異譜圖；再通過儀器內置NIST 2014數據庫和自建IMS數據庫進行揮發性成分定性分析，儀器詳細參數設置如下：

頂空孵化溫度90 ℃；孵化時間1 min；加熱方式：振蕩加熱；頂空進樣針溫度95 ℃；進樣量500.0 μL，不分流模式；載氣：高純N2(純度≥99.99 %)；清洗時間0.5 min。

GC條件：色譜柱溫度40 ℃；運行時間20 min；載氣：高純N2(純度≥99.99%)；流速：初始5.0 mL/min，保持10 min后在5 min內線性增至150 mL/min。漂移管長度5 cm；管內線性電壓400 V/cm。

IMS條件：色譜柱(MXT-5，15 m，0.53 mm ID，1 μm FT)；柱溫60 ℃；漂移氣(N2，純度≥99.99%)；流速150 mL/min；IMS探測器溫度45 ℃；分析時間30 min。

1.4 數據統計分析

利用風味儀Laboratory Analytical Viewer(LAV)和Reporter、Gallery Plot 3個插件分析數據，由內置GC×IMS Library Search NIST 2014和IMS數據庫對樣品風味成分定性。利用Origin 8.5繪制不同組分相對含量變化柱狀圖；SIMCA-P 14.1軟件進行正交偏最小二乘-判別法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)建模分析。ClustVis在線統計工具(https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)進行主成分及聚類熱圖繪制。

2 結果與分析

2.1 不同烤制時間大鯢肉GC-IMS風味成分譜圖分析

圖2是烤制過程中大鯢肉揮發性風味成分3D譜圖。譜圖離子峰上每個化合物可能會有1、2個斑點(指示單體或二聚體)，受到揮發性有機物含量和狀態的影響[13]。從譜圖外觀可見，不同烤制時間大鯢肉樣品的GC-IMS三維譜圖肉眼不容易直接區分。

圖2 不同烤制時間大鯢肉GC-IMS三維譜圖Fig.2 Three dimensional GC-IMS spectra of giant salamander meat at different roasting time

將圖2中3D GC-IMS圖轉換生成二維俯視平面圖(圖3)，能直觀對比分析不同烤制時間大鯢肉揮發性風味物質的細微差別。由圖3可見，不同烤制時間大鯢肉樣品揮發性風味成分通過GC-IMS技術可以得到較好地識別與分離，不同烤制時間大鯢肉表現出相對特征性的GC-IMS圖譜。同時，不同烤制時間大鯢肉樣品中某些揮發性成分濃度有升高或降低，具有一定的差異(圖3-b紅色方形、橢圓虛線框區域)。本文利用GC-IMS技術對不同烤制時間大鯢肉揮發性風味成分進行檢測，發現不同烤制時間大鯢GC-IMS特征譜具有一定差異，究其原因可能與烤制過程中脂肪氧化、水分蒸發以及美拉德反應等綜合因素有關[17-19]。

2.2 大鯢肉烤制前期GC-IMS揮發性風味成分定性分析

經過對比特征性風味成分的保留時間和遷移時間，通過GC-IMS內置數據庫搜索從而實現揮發性物質的定性分析。圖4為對烤制初期大鯢肉樣品Library Search定性分析結果(以0 min為例，其他烤制時間未顯示)，圖中信號峰旁的數字，表示1個具體風味化合物。調用風味儀NIST 2014氣相保留指數與IMS遷移時間數據庫，從不同烤制時間大鯢肉60個信號峰中，鑒定出43種揮發性有機化合物(表1)，可大體分為9種醇類、8種醛類、8種酮類、7種烯類、6種酯類、2種醚類、2種吡嗪類和1種酚類。

a-俯視圖；b-對比圖圖3 不同烤制時間大鯢肉GC-IMS二維譜圖Fig.3 Two dimensional GC-IMS spectra of giant salamander meat at different roasting time

圖4 烤制前期大鯢肉揮發性風味物質離子 遷移譜定性分析Fig.4 IMS qualitative analysis of volatile flavor compounds of giant salamander meat before roasting

表1 不同烤制時間大鯢肉中鑒定的揮發性風味物質Table 1 Volatile flavor compounds identified from giant salamander meat at different roasting time

2.3 不同烤制時間大鯢肉揮發性成分指紋圖譜

為解析不同烤制時間大鯢肉揮發性風味物質的差異性，利用不同烤制時間大鯢肉3次測試的GC-IMS二維圖譜中全部信號峰，構建了不同烤制時間大鯢肉揮發性風味指紋圖譜。如圖5所示，橫向指示不同烤制時間大鯢肉樣品(從上至下分別為烤制0、20、40、60和80 min)，縱向指示烤制過程中大鯢肉中同一揮發性有機物(顏色越深，反映該物質含量較大)[10，11,13]。由圖5橫縱向譜圖差異對比可見，不同烤制時間大鯢樣品揮發性有機物質顯示較大差異(圖5紅框區域)，其中未烤制大鯢肉(0 min)的揮發性有機物中，以壬醛、2-乙基己醇、丁酸乙酯、戊醇(單體、二聚體)、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、2-庚酮、異戊醛、己醛單體含量相對較高(圖5中紅色框區域A1和A2區域)，與前期報道的大鯢不同可食部位揮發性有機物成分差異較大[4]，可能是原料新鮮狀態、調味料腌制等因素造成。與未烤制相比，大鯢肉烤制后揮發性風味物質種類和含量明顯增加(圖5)，這與魚類熱加工后揮發性風味成分變化趨勢相同[11,19]。

圖5 不同烤制時間大鯢肉揮發性成分Gallery指紋譜圖Fig.5 Gallery fingerprint of volatile organic compounds of giant salamander meat at different roasting time注：每個斑點代表1種揮發性風味物質，圖下方為已定性的化合物名稱，數字表示未定性化合物(下同)

隨著烤制時間的延長(20～80 min)，大鯢肉揮發性有機物中壬醛、2-乙基己醇、丁酸乙酯、戊醇(單體、二聚體)、乙酸異戊酯、乙酸乙酯含量急劇下降。與0 min相比，烤制20～40 min時大鯢肉中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、二丁基硫醚、芳樟醇、桉葉油醇(單體、二聚體)、雙戊烯、α-葑烯、α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、2-甲基-1-丁醇、3, 5-二甲基-2-乙基吡嗪、反-2-戊烯醛、1-辛烯-3-酮、2, 3-丁二醇、甲基庚烯酮、2-甲基丁酸乙酯和苯甲醛含量明顯增多(圖5紅框中B、C區域)；但是隨著烤制時間從40增加到60 min，這些揮發性有機物含量逐漸下降，而苯甲醛、2-庚酮(單體、二聚體)、2-丁酮、異戊醛、2-戊酮、2-甲基吡嗪、丁醇、3-戊酮、辛醛、苯乙烯、丁酸丁酯(單體、二聚體)、乙酸異戊酯含量逐漸增加(圖5紅框中C、D區域)；烤制時間從60繼續增至80 min過程中，大鯢肉中苯甲醛、2-庚酮(單體、二聚體)、2-丁酮、異戊醛、2-戊酮、2-甲基吡嗪、丁醇含量逐漸降低，而辛醛、苯乙烯、丁酸丁酯(單體、二聚體)、乙酸異戊酯、己醛(單體、二聚體)、庚醛和甲基叔丁基醚含量逐漸增加(圖5中D、E區域)。

肉類熱加工過程中揮發性成分較為復雜，具有多樣性，總體包含醇類、酮類、醛類、萜烯衍生物、烴類以及少量呋喃、硫醚、萘類等有機化合物[10,12,17]。為了更好表征各類揮發性化合物的變化，根據化合物在指紋圖譜上的信號強度，換算得到不同烤制時間下大鯢肉中揮發性組分的相對含量變化(圖6)。從圖6中可看出，大鯢烤肉中揮發性成分以酮類、醇類為主，其次是醛類、酯類和烯類。大鯢烤肉中檢測到酮類物質相對含量為27.47%～39.67%，由甲基庚烯酮、2-庚酮、1-辛烯-3-酮、3-羥基-2-丁酮、2-丁酮、2-戊酮和3-戊酮構成；醇類物質相對含量為19.54%～48.95%，由芳樟醇、2-乙基己醇、桉葉油醇、戊醇、2-甲基-1-丁醇、2,3-丁二醇和丁醇構成；醛類物質相對含量為8.18%～21.34%，由壬醛、辛醛、庚醛、己醛、苯甲醛、反-2-戊烯醛和異戊醛構成；烯類物質相對含量為8.09%～25.09%，由雙戊烯、α-葑烯、苯乙烯、α-蒎烯、苯乙烯、β-蒎烯、3-蒈烯構成；酯類物質相對含量為6.37%～11.34%，由丁酸丁酯單體、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸丁酯二聚體、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯構成。

醛類物質主要為脂肪氧化的產物，閾值較低，對肉類總體揮發性風味影響較大；酮類和醇類物質也來源于脂肪酸的氧化降解，其閾值高于醛類，帶有花香、水果香等令人愉悅的風味；酯類物質主要是酸類和醇類物質酯化反應的產物[19-20]。從圖6中可知，大鯢肉烤制前以醇類(33.66%)、醛類(21.34%)、酮類(19.54%)和酯類(22.07%)為主，含有微量吡嗪類、酚類化合物。與烤制前0 min相比，大鯢肉烤制20 min后，醛類、醇類和酯類含量有所下降，而酮類、烯類、醚類化合物相對含量有所上升；隨著烤制時間從20增加到80 min，烤制大鯢肉中醇類、烯類、醚類化合物含量逐漸降低，而酯類、酮類、醛類化合物相對比例逐漸增加。肉制品熱加工過程中，由于脂肪氧化降解的程度加深，醛類、酮類物質比例上升，對肉類風味產生重要影響，特別是酮類物質對于水產品降低腥味有較大貢獻[19]。本研究中烤制中后期(40～80 min)，大鯢肉中揮發性有機物以酮類、醇類和醛類為主，主要是不飽和脂肪酸的氧化降解或氨基酸的Strecker降解反應產生[10,17]，可能是大鯢烤肉風味形成的基礎。

圖6 大鯢肉烤制過程中揮發性組分相對含量變化Fig.6 Fingerprint of volatile organic compounds of giant salamander meat at different roasting time

2.4 OPLS-DA及模型驗證

OPLS-DA是一種基于目標成分與樣品類別關系模型的統計算法。利用OPLS-DA中的score plot對不同烤制時間下大鯢肉樣品中的揮發性有機物質進行分類，結果如圖7所示。隨機改變分類變量的排列順序建立相應的模型，圖中RX2(cum) =0.966，RY2(cum) =0.879，當R2和Q2的值處于0.5～1時，表明模型有較好的概括解釋率：Q2(cum) =0.714，表示模型有較好預測能力[21]。

圖7 不同烤制時間大鯢肉揮發性成分OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA analysis of giant salamander meat at different roasting time

本研究中模型穩定性和預測性能較好，提示構建的模型穩定性及預測能力均符合要求，可用于區分烤制過程中大鯢肉揮發性風味物質的差異，與徐永霞等[11]在構建海鱸魚蒸制過程中的OPLS-DA模型參數結果相近。

利用置換檢驗對OPLS-DA所做的模型進行驗證，根據樣本數據的隨機排列情況進行統計學推斷[11,21]。它將樣本進行順序上的置換(permutation test，n=200)，重新得出統計檢驗量，構造經驗分布，以此為基礎進行建模。圖8中Q2代表累計交叉有效性，其值與模型預測能力成正比關系；R2代表累計方差值，表示有多少原始數據被用來建立OPLS-DA判別模型，其值大反映出模型解釋變異好[21-22]。對OPLS-DA模型進行擬合，得到RX2=0.966，RY2=0.879，Q2=0.714，提示所建模型擬合效果較好。為了繼續驗證模型是否存在過擬合，將部分樣本類別進行200次的置換擬合，結果見圖8-a，圖中R2與左邊縱軸相交(0，0.718)，Q2與左邊縱軸相交(0，-0.459)，R2和Q2兩條回歸線斜率相對較大，左邊隨機排列產生的實驗值R2和Q2值均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距是負數，說明OPLS-DA判別模型無過擬合現象，模型可用于不同烤制時間大鯢肉揮發性成分的分類判別。

通過GC-IMS指紋圖譜，將不同烤制時間下的大鯢肉樣品43種揮發性化合物的關系進行可視化。依據OPLS-DA模型中的變量重要性(VIP值)將每個變量對分類的貢獻進行量化，篩選VIP值>1的揮發性有機物作為潛在的特征風味成分，結果如圖8-b所示。圖8-b中大鯢肉烤制過程中共有14種特征揮發性風味物質VIP>1，包括醇類4種(丁醇、桉葉油醇單體、戊醇二聚體和2, 3-丁二醇)、醛類3種(己醛二聚體、異戊醛和反-2-戊烯醛)、酮類4種(甲基庚烯酮、2-丁酮、3-戊酮和2-戊酮)、烯類2種(α-葑烯和雙戊烯)以及酯類1種(乙酸乙酯)。該結果與徐永霞等[11]利用GC-IMS建立了海鱸魚蒸制過程中OPLS-DA模型，并通過VIP值確定了11種特征揮發性標志化合物較為相似。

2.5 不同烤制時間大鯢肉特征揮發性風味物質主成分及聚類分析

為直觀區分不同烤制時間大鯢肉特征揮發性化合物的變化，對篩選的14種特征性化合物成分進行主成分和聚類分析，結果見圖9。主成分分析表明，烤制過程中篩選的14種特征性有機物PC1和PC2，分別為48.7%和33.4%，總和為82.1%，能夠解釋樣本總體的變異[23-25]；而且同一烤制時間大鯢肉樣品中14種特征風味物質相對聚集，能夠較好區分不同烤制時間大鯢肉樣品(圖9-a)。

a-OPLS-DA擬合曲線；b-VIP值分布圖8 不同烤制時間大鯢肉揮發性成分OPLS-DA 擬合曲線及VIP值分布Fig.8 OPLS-DA simulation and VIP distribution of giant salamander meat volatile components at different roasting time

通過這些風味化合物的信號強度繪制聚類熱圖，如圖9-b所示。不同烤制時間下大鯢肉樣品14種特征揮發性有機物差異，大鯢烤肉風味特征大致分為3類，分別為烤制前(0 min)、烤制初期(20、40 min)、烤制中后期(60、80 min)。未烤制大鯢肉中揮發性特征有機物的種類較少，其中丁醇、異戊醛、乙酸乙酯和戊醇二聚體含量相對較多；烤制初期(20～40 min)特征性有機物種類和含量逐漸增加，其中反-2-戊烯醛、甲基庚烯酮、2,3-丁二醇、桉葉油醇單體、α-葑烯和雙戊烯含量明顯增加，反-2-戊烯醛、甲基庚烯酮、2,3-丁二醇可能來源于高溫下蛋白質、糖類、脂質等成分的聚合、降解反應，而桉葉油醇單體、α-葑烯和雙戊烯可能由于香辛料中高溫加熱揮發造成含量上升[17,19,26]?？局浦泻笃?，其中烤制60 min后14種特征性有機物種類和含量最多，可能由于高溫脂肪氧化、美拉德反應等原因產生了較多的揮發性有機化合物[19,27-28]，結合烤制過程中實際感官色澤，烤制60 min后色香味相對較好，可作為大鯢烤肉的整體揮發性風味輪廓；烤制80 min后這些物質含量有所下降，伴隨一定的感官品質劣變。本研究通過GC-IMS和OPLS-DA模型中變量重要性(VIP值>1)初步篩選了大鯢烤肉14種潛在特征風味物質，但是由于未對其進行定量分析，今后還需要結合GC-MS、GC-O和相對氣味活性值深入揭示大鯢肉烤制過程中揮發性風味物質精細變化[15,30]。

a-主成分得分圖；b-聚類熱圖圖9 不同烤制時間大鯢肉特征揮發性物質主成分及 聚類熱圖分析Fig.9 PCA score and clustering heatmap of characteristic volatile organic compounds of giant salamander meat at different roasting time

3 結論

采用GC-IMS初步確定了不同烤制時間大鯢肉揮發性風味物質。從大鯢烤肉中共鑒定出43種揮發性有機化合物，包括醇類9種、醛類8種、酮類8種、烯類8種、酯類6種、醚類2種、吡嗪類2種和酚類1種。大鯢肉烤制前以醇類(33.66%)、醛類(21.34%)、酮類(19.54%)和酯類(22.07%)為主，含微量吡嗪類、酚類化合物。與烤制前相比，大鯢肉烤制20 min后，醛類、醇類和酯類含量有所下降，而酮類、烯類、醚類化合物相對含量有所上升；隨著烤制時間從20增加到80 min，大鯢肉中醇類、烯類、醚類化合物含量逐漸降低，而酯類、酮類、醛類化合物相對比例逐漸增加。采用OPLS-DA建立了穩定性和預測能力較好的模型，從43種揮發性有機物中篩選出14種潛在特征標志物(VIP>1)，包括4種醇類(丁醇、桉葉油醇單體、戊醇二聚體和2, 3-丁二醇)、3種醛類(己醛二聚體、異戊醛和反-2-戊烯醛)、4種酮類(甲基庚烯酮、2-丁酮、3-戊酮和2-戊酮)、2種烯類(α-葑烯和雙戊烯)和1種酯類(乙酸乙酯)。主成分分析表明，2個主成分累計貢獻率為82.1%，通過這些揮發性成分可進行大鯢肉烤制階段的區分。