離線固相萃取-氣相色譜法定量分析巧克力中飽和烴類礦物油

張洋,李曉娟*,汪春明,施鵬斐,李淑娟

1(中檢科(北京)測試技術有限公司，北京，100123)2(中國檢驗檢疫科學研究院，北京，100123)

礦物油是原油經過物理分離(蒸餾、萃取)和化學轉化(加氫反應、裂解、烷基化和異構化)過程形成的碳數為10～50的烴類混合物，主要包括直鏈、支鏈及環狀的飽和烴礦物油(mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH)和聚芳烴化合物組成的芳香烴礦物油(mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH)2類[1]。礦物油在生產、生活中的用途十分廣泛，可用作油墨、涂料的溶劑、農藥的乳化劑、食品和化妝品的生產助劑、機械潤滑劑等[2]。礦物油用途廣泛從而導致食品污染的來源豐富。食品接觸材料，尤其是殘留在回收紙、再生紙包裝中的印刷油墨，這部分的礦物油向干性食品中的遷移量最高可達到100 mg/kg[3]；食品生產助劑使用的食品級白油，如面包脫模劑、口香糖的膠姆糖基礎劑、水果的表面處理劑等。有研究發現，甜面包中礦物油的殘留量為910 mg/kg[4]。食品原材料收割、晾曬、加工過程中接觸到的發動機潤滑油、未完全燃燒的汽油、瀝青碎屑等也是食品中礦物油的來源。礦物油毒理學研究發現，人體皮下脂肪、淋巴結、脾臟、肝臟、肺、腎臟等器官中均含有相當數量的MOSH，其中以淋巴結和脾臟中MOSH含量最高[5]。歐洲食品安全局的研究顯示，MOSH(C16～C35)經膳食攝入后在體內積聚，會導致淋巴結、脾臟和肝臟等器官產生肉芽腫和慢性炎癥。有研究發現，MOSH是人體內累積量最大的污染物[6]，其主要來源于食物攝入。因此，食品中MOSH的污染物值引起人們關注[7]。

近年來，多起巧克力中礦物油檢出事件被社會所關注。因此，加強巧克力中MOSH的監測非常必要。MOSH化學組成復雜，分為直鏈或支鏈烷烴礦物油。氫火焰離子化檢測器(gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID)因其對碳響應特點成為目前MOSH定量測定的首選方法。然而，單純使用GC-FID，其選擇性差、靈敏度偏低，且需要凈化與富集目標物[8]。目前，液相色譜與氣相色譜聯用(LC-GC)是最高效的礦物油分析技術，它通過接口技術實現LC與GC的在線凈化、富集，有效提高了信噪比和靈敏度[9-11]。但LC-GC儀器組裝繁瑣且使用維護成本高，難以批量普及。固相萃取(solid-phase extraction，SPE)凈化技術成為常用的解決途徑[12-15]。

本實驗采用SPE-GC-FID建立巧克力中MOSH的檢測方法，其創新之處在于：(1)采用了操作簡便的SPE柱凈化方法并優化了凈化條件；(2)根據巧克力前處理的干擾情況，選擇了合適的內標[環己基環己烷(bicyclohexyl，Cycy)]進行準確定量。該方法操作簡便、實驗條件要求不高，適用于巧克力中MOSH含量的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8個巧克力樣品，市購；正己烷、丙酮(均為色譜純)，美國Fisher Scientific公司；硅膠(160～200目)、10%硝酸銀硅膠(160～200目)，日本wako公司；MOSH標準溶液，德國Dr.E公司；Cycy、膽甾烷(5-α-cholestane，Cho)、C8～C40正構烷烴混合標準溶液，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

GC—2030氣相色譜儀(配備FID)，日本Shimadzu公司；EVA50A氮氣吹干儀，北京普立泰科儀器有限公司；Milli-Q超純水設備，美國Millipore公司；KS501振蕩器，德國IKA公司；N1000旋轉蒸發儀，日本EYELA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品配制

標準儲備溶液：分別準確稱取MOSH、Cho、Cycy標準品10 mg，由正己烷定容至10 mL，得到1 000 mg/L標準儲備液。

標準中間溶液：分別準確移取上述1 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，得到100 mg/L標準中間溶液。

標準工作溶液：分別移取100 mg/L MOSH標準中間溶液 10、100、200、500、800 μL，用990、900、800、500、200 μL正己烷定容至1 mL。即得到1、10、20、50、80 mg/L工作標準溶液。

1.3.2 樣品提取

準確稱取巧克力樣品2.0 g于50 mL具塞錐形瓶中，加入50 μL 100 mg/L Cycy內標溶液，20 mL正己烷溶劑，振蕩1 h后靜置過夜。取10 mL上清液用旋轉蒸發儀濃縮至0.5 mL，用正己烷定容至1 mL待用。

1.3.3 樣品凈化

1.3.3.1 0.3%硝酸銀硅膠制備

稱取97 g硅膠于500 mL鋁箔紙包裹外壁的圓底燒瓶中，再加入3 g質量分數10%硝酸銀硅膠，然后用旋蒸儀繼續混勻3 h，后放入115～120 ℃烘箱干燥12 h。即得到0.3%硝酸銀硅膠，于干燥器內避光保存，2周內使用。

1.3.3.2 SPE柱制備及凈化

取10 mL玻璃注射器，外部用鋁箔紙包裹避光，底部放入尺寸合適的經正己烷浸泡的玻璃纖維濾紙，裝填3 g 0.3%硝酸銀硅膠，敲實排出氣泡，上面再放入1層濾紙。用10 mL正己烷預淋洗SPE柱，棄去流出液，待液面接近硝酸銀硅膠填料時，加入濃縮液(1.3.2)，待濃縮液接近硝酸銀硅膠填料約1 mm時，用5 mL正己烷洗脫并開始接收，待液面接近硝酸銀硅膠填料，加入5 ml正己烷。收集上述洗脫液后，在40 ℃下濃縮至約0.5 mL，待測。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-5石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為高純氮氣，柱流量1.5 mL/min；進樣量2 μL。進樣口溫度275 ℃；GC分析條件：起始溫度50 ℃，然后以2.5 ℃/min升溫至60 ℃，再 以22 ℃/min升溫至280 ℃，然后以30 ℃/min升溫至320 ℃保持12 min；FID條件：檢測器溫度350 ℃，氫氣流量30 mL/min，空氣流量 300 mL/min，補償氣為氮氣，流量為25 mL/min

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

MOSH屬于非極性有機物，常用石油醚、乙醚、正己烷等溶劑利用相似相溶原理進行提取。但石油醚是一類混合物，有可能引入對MOSH檢測有影響的物質；乙醚具有較強的毒性，本實驗中有大量濃縮操作，乙醚蒸氣可能對實驗人員健康和實驗環境帶來不良影響，因此最終選取正己烷作為樣品中MOSH的提取溶劑。在通常的油脂提取中會采用酸水解法，打破乳脂油膜，將巧克力中的油脂提取出來。但巧克力中的MOSH主要源于加工、包裝等操作帶來的外部引入。因此，本實驗采用正己烷浸泡過夜法對巧克力中MOSH進行提取[16]。

2.2 凈化填料的選擇

針對巧克力提取溶液中主要干擾物為非極性油脂，含有大量的脂肪及萜烯類等物質，選取極性較強的硅膠填料可以達到較好的凈化效果。硅膠經過高溫活化后不僅可以增強吸附能力，還能夠消除其他可能的干擾。硝酸銀硅膠是在硅膠的基礎上絡合 AgNO3所形成，它基于 AgNO3與含有雙鍵(或不飽和鍵)的物質結合形成配合物，且不同物質形成的配合物的穩定系數不同，通過不同極性的洗脫溶劑洗脫，從而達到分離的目的，其較硅膠而言保留含不飽和鍵的極性干擾物的能力更強[17]，含有硝酸銀的硅膠對角鯊烯等烯烴干擾物有良好的凈化效果[13]。因此，采用硝酸銀硅膠作為SPE柱填料用于吸附巧克力提取液中的油脂和烯烴，從而達到凈化的目的。

2.3 硅膠填料中硝酸銀含量的優化

硅膠填料中硝酸銀的含量對SPE柱的凈化效果有直接的影響，但目前對食品中礦物油組分進行凈化的SPE柱還未商品化。本實驗對0.3%、0.5%、1.0% 3種不同硝酸銀含量的硅膠的凈化效果進行對比。比較了3種不同填料對油脂的凈化能力。將0.2 mL混合標準溶液加入巧克力提取液中經濃縮后定容至1 mL，分別上樣至3種硝酸銀含量的硅膠SPE柱中，采用正己烷洗脫，分別接收1 mL洗脫液，隨后注入GC分析。結果表明，在3種不同SPE柱上的飽和礦物油的回收率差異不顯著(圖1)，都能滿足巧克力的凈化要求。而硝酸銀含量高的硅膠柱更容易受光照的影響，對避光條件和實驗操作的要求更高，因此選擇使用0.3%硝酸銀硅膠為凈化填料。

圖1 不同硝酸銀含量對回收率的影響Fig.1 Effect of silver nitrate content on recovery

2.4 洗脫體積的優化

在確定了硝酸銀質量分數以后，本實驗通過使用MOSH和Cho混合標準工作溶液，來考查不同洗脫液體積對MOSH回收率和MOSH標記物(Cho)的流出情況(圖2)。

由圖2可知，當用2 mL正己烷洗脫時，MOSH和Cho均沒有回收；當用4 mL正己烷洗脫時，礦物油的回收率增加到27%，Cho回收率為3%；當用6 mL正己烷洗脫時，礦物油的回收率為48%，Cho回收率為15%；當用8 mL正己烷洗脫時，礦物油的回收率為85%，Cho回收率為36%；當用10 mL正己烷洗脫時，礦物油的回收率為93%，Cho回收率為68%，標志著MOSH部分已經基本全部洗脫下來；之后隨著正己烷洗脫體積的增加(12 mL與14 mL)，礦物油的回收率與使用10 mL正己烷洗脫液時差異不大，但Cho的流出量顯著增加?？紤]到增加洗脫體積會使其他弱極性干擾物增加。因此最終采用10 mL正己烷洗脫。

圖2 洗脫體積對MOSH與Cho回收率的影響Fig.2 Effect of different elution volumes on MOSH and Cho recoveries

2.5 儀器條件的優化

2.5.1 GC升溫速率的優化

MOSH的譜圖是1個“駝峰”式的寬峰，具有較長的保留時間。為了提高寬峰的高度，以便更好的定量。通常采用較快的程序升溫速率，使色譜峰更為“尖銳”，以提高靈敏度。文獻中大多采用的升溫速率為20～25 ℃/min，有的高達50 ℃/min[16]。為了保持譜圖的基線穩定，同時使正構烷烴C8～C40較為合理的分布在整個色譜圖中，本實驗優化GC的升溫程序為：起始溫度50 ℃，然后以2.5 ℃/min升溫至60 ℃，再以22 ℃/min升溫至280 ℃，然后以30 ℃/min升溫至320 ℃保持12 min。

2.5.2 定量方法的優化

由于礦物油作為一種混合物，峰形比較寬大，容易受到樣品制備和進樣過程的影響。因此使用內標法可以有效減少上述因素的影響。選取1個合適的內標對定量有較大的影響。內標法要求內標物應不受被測樣品干擾，保留時間相近又可以完全分離。經過研究，當選取Cycy作為巧克力提取液中MOSH的定量內標時，樣品的共流出干擾物較少。

同時由于礦物油的“駝峰”形態，導致對色譜峰積分的起始時間要求很高。需要建立確定的積分條件才能保證定量結果的準確性和再現性。MOSH的中低黏度部分對人體的危害最大，也是主要關注的部分。因此，本實驗采用正構烷烴(n-C8～C40)中C16和C35的保留時間作為MOSH峰積分的起點和終點。從而使定量結果獲得較好的準確性和可操作性(圖3～圖5)。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性范圍

將1.3.1節配制的MOSH系列工作溶液，在1.3.4節條件下分析。以GC譜圖中的峰面積(y)與相應質量濃度(x)繪制曲線，所得標準曲線為y=65 878.4x-57 113.2，相關系數0.999，說明MOSH在1～80 mg/L質量濃度內線性關系良好。

圖3 空白樣品氣相譜圖Fig.3 GC chromatogram of blank sample

圖4 標準樣品中飽和礦物油氣相譜圖Fig.4 GC chromatogram of MOSH in standard sample

圖5 實測樣品中飽和礦物油氣相譜圖Fig.5 GC chromatogram of MOSH in test sample

2.6.2 定量限(limit of quantification, LOQ)

本實驗將2.0 g巧克力用20 mL正己烷提取，分別取10 mL提取液濃縮至1 mL，上樣至SPE柱凈化，用10 mL洗脫液洗脫并濃縮至0.5 mL，注入GC-FID分析的體積為2 μL，因此對應的巧克力中MOSH的LOQ為0.5 mg/kg。

2.6.3 回收率

選取巧克力作為樣品基質，分別添加MOSH標準溶液進行回收率實驗，添加量為0.5、2.0、20.0 mg/kg。提取液經0.3%硝酸銀浸漬硅膠SPE柱凈化，每個試樣及空白分別平行測定5次，計算平均加標回收率和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)(表1)。結果表明，加標回收率為90%～99%，相對標準偏差為6.1%～9.9%，該方法的回收率和相對標準偏差均符合檢測要求。

表1 MOSH的回收率和相對標準偏差(n=5)Table 1 Recovery and relative standard deviation of MOSH(n=5)

2.7 實際樣品檢測

采用上述方法檢測了市售不同廠家與品牌巧克力中MOSH含量。結果如表2所示，8 個巧克力中只有樣品1、2和6未檢出MOSH，其余5個樣品的MOSH含量在1.2～5.1 mg/kg。按照聯合國糧農組織和世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會規定的中低黏度礦物油(Ⅱ類和Ⅲ類)的每日容許攝入量(acceptable daily intake，ADI)0.01 mg/kg BW估算[18-19]，1個體重60 kg的成年人每日允許攝入MOSH的上限是0.6 mg。2014年，德國聯邦食品及農業部建議，碳鏈長度介于C20～C35的MOSH在食品中遷移量不應超過2 mg/kg；其他研究者認為C20～C35的MOAH遷移量不應超過0.5 mg /kg[13]；然而目前國內暫無MOSH在巧克力中的最大殘留限量，僅GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規定在除膠基糖果以外的其他糖果和鮮蛋中用于被膜劑的食品級白礦物油的最大使用量為5 g/kg。按照上述檢出MOSH的巧克力的含量計算，每日允許攝入的上述巧克力的質量在0.12～0.5 kg。由于目前我國居民的膳食攝入統計中尚無巧克力類食品的數據，但估計上述巧克力攝入量高于日常攝入量，巧克力中MOSH對成人的危害較小。但食品中MOSH來源廣泛[20]，本次檢測的巧克力數量較少，尚不能代表巧克力中MOSH的實際殘留水平，同時MOSH對嬰幼兒等特殊人群的危害研究尚少。所以進一步加大巧克力的檢測范圍與數量，對掌握我國市售巧克力中MOSH情況十分必要，對巧克力中存在的MOSH應引起進一步關注。

表2 不同巧克力中的 MOSH 含量 單位：mg/kg

3 結論與討論

本實驗建立了一種硝酸銀硅膠SPE柱凈化，采用優化后的程序升溫 GC-FID法測定巧克力中MOSH的檢測方法。其結果滿足方法學與相關控制標準的要求。本方法操作簡單、成本低，適用于實驗室對巧克力中MOSH的檢測。用本方法測定了8個市售巧克力中MOSH的含量，結果表明，僅有3個樣品未檢出，其中25%的巧克力中MOSH(C16～C35)的含量超過了德國聯邦食品及農業部建議遷移量，因此建議相關部門加強巧克力中礦物油污染物的監管。