植物露酒中黃酮類化合物功效及檢測技術研究進展

黃婷，劉茗銘，王媚，馮方劍，趙金松,*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000) 2(四川省酒業集團有限責任公司 川酒研究院，四川 成都，610000)

露酒又稱配制酒，是一種以發酵酒、蒸餾酒或食用酒精為酒基，加入食用或藥食兩用的動植物精華，經再加工而成，改變了原酒基風格的酒種[1]。露酒按不同成分可分為植物露酒、動物露酒及動植物露酒和其他類露酒，其中植物露酒，是在選定的酒基中，加入藥食兩用的植物，進行浸提、調配、混合或再加工而成的、具有一定保健功能和特定植物香的飲料酒[2]，是中國露酒工業的重要組成部分。

植物露酒不僅具有相應的植物香和酒香，且多種功能活性因子的存在，使其還具有特定的保健功能，符合了當代人追求健康生活的需求，其中黃酮類活性成分在植物露酒中占比較大。近年來，國內外學者對其研究越來越深入，目前已被發現黃酮類物質賦予植物露酒的功能特性主要有抗氧化、抗癌、降血脂、抗疲勞、抗菌等生物活性[3]，促使黃酮類化合物功能性研究成為植物露酒研究的熱點之一。但由于植物露酒原料來源廣泛，致使不同植物露酒中黃酮類化合物種類和含量差異較大，難以形成通用標準，導致植物露酒品質參差不齊。因此，快速準確的定量檢測分析技術對植物露酒中黃酮類化合物研究具有重要意義。本文綜述了植物露酒中黃酮類物質的功能特性及其定量檢測分析技術的研究現狀，并對國內外植物露酒黃酮類化合物研究的發展趨勢進行預測，旨在為植物露酒功能性研究及檢測分析技術提供參考。

1 植物露酒的發展趨勢

植物露酒以其個性化的外觀、淡雅的口感及特殊的功能性滿足了人們生活多樣化需求，得到了消費者的青睞。近年由于國外露酒(利口酒)款式新穎，口味多樣深受國人喜愛。例如市售火爆的野格利口酒、百利甜酒等。國外進口利口酒漲幅驚人，數據顯示，從2015年的4 480.78 kL逐漸增長到了2018年的9 205.92 kL，每年平均增長速率大約為28%，2018年到2019年利口酒進口量達到了23 625.12 kL，同比增長速率可達157%左右，與2015年進口量相比，增長了5.3倍(圖1)[4]。相反，據中國海關數據顯示[5]，2019年中國白酒的出口量從2018年的1 721.0萬L減少到1 638.6萬L，同比增長速率為-4.8%(圖2)。

圖1 國外利口酒進口量及增長趨勢Fig.1 Imports and growth trend of foreign liqueur

圖2 中國白酒出口量及增長趨勢Fig.2 Exports and growth trend of Chinese Baijiu

可見，國內露酒需求量正在不斷攀升，而中國白酒出口量有所下降，全球對露酒等酒種的需求量在不斷增加。因此，國內與之相關的生產企業需要加大研發力度，促使露酒行業快速發展，滿足人們對露酒產品的特殊需求。其次，植物露酒又是主力軍，為保證品質，對其質量和有效成分的把控尤為重要。

2 植物露酒中黃酮類化合物種類及其功能特性

黃酮類化合物(flavonoids)是在水果、蔬菜、谷物、樹皮、根莖葉和植物露酒中發現的天然苯基色酮類化合物，泛指兩個芳環(A環、B環)之間以一個三碳鏈相連的一系列化合物的總稱，其骨架可以表示為C6-C3-C6，在植物體內，葡萄糖分別經過乙酸、丙二酸途徑和莽草酸途徑生成乙酸和羥基桂皮酸，合成前體物質查爾酮，進一步氧化脫氫形成黃酮類化合物[6]。其主要分為異黃酮類(isoflavones)、異黃烷酮類(isoflavanones)、黃酮醇(flavonols)、黃烷酮(flavanones)、黃酮類(flavones)、花色素類(anthocyanidins)以及黃烷醇類(flavanols)、查爾酮類(chalcones)、橙酮類(aurones)和雙黃酮類(biflavones)。目前，黃酮化合物種類及其功能特性在植物露酒中的應用見表1。

表1 植物露酒中黃酮類化合物種類及其功能特性Table 1 Types and functional characteristics of flavonoids in plant liqueur

3 植物露酒中黃酮類化合物功能特性研究

抗氧化、降血脂和抗癌(肝癌)等功能性是飲酒人最關注的問題，也是當下植物露酒品質研究的重要內容。因此，對黃酮類化合物的功能性評價是新型植物露酒研制過程中不可或缺的環節，也是植物露酒質量和功能性的重要保障。

3.1 抗氧化活性

抗氧化活性是目前研制新型植物露酒時，重點考察的功能性指標之一。研究發現，在一定反應體系下，黃酮類化合物濃度越高時，該植物露酒的抗氧化活性就越強[16]，促使露酒中黃酮類化合物的抗氧化機理研究得到進一步發展，即主要通過抑制自由基的產生實現抗氧化功能，其獨特的多羥基結構能與機體代謝產生的自由基相結合，達到阻止細胞退化、衰老的目的。如當人們攝入過量的脂肪類食物時，以植物露酒為佐餐，能有效降低冠心病的發病率，原因是酒中黃酮類物質減少了脂質代謝產物，達到抗氧化的作用，有效防止了動脈粥樣硬化；另外，植物露酒中黃酮類化合物的多個芳環(A環、B環)和酚羥基等結構使其能與蛋白質結合，作用于星型膠質細胞中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)蛋白，促進LDH的體外釋放，達到抗氧化的目的[17]。

植物中黃酮類化合物在露酒中能夠充分發揮其抗氧化活性。淫羊藿是一種富含黃酮類化合物的藥用物質，張翔等[16]以淫羊藿為原料，研制保健類植物露酒，在最優浸提條件下，該露酒中總黃酮含量為297.08 mg/L，與普通植物露酒相比，淫羊藿露酒抗氧化能力更強，且隨著淫羊藿露酒黃酮類化合物濃度在反應體系中不斷增加，其對DPPH自由基的清除能力逐漸提高。另外，方堃等[18]通過對藍莓露酒的DPPH自由基清除能力評價，確定了該露酒的最佳浸提工藝條件(料液比1∶1、乙醇體積分數60%、超聲波時間40 min)，當黃酮類化合物質量濃度為(2.414±0.314) mg/mL時，所得植物露酒的DPPH自由基清除率高達66.3%。在植物露酒抗氧化評價試驗中，可通過對酒中黃酮類化合物的含量測定，初步判定該酒的抗氧化活性強弱。

表2 植物露酒抗氧化功能性評價研究進展Table 2 Research progress on functional evaluation of plant liqueur

現階段，隨著抗氧化活性研究不斷深入，特定自由基檢測試劑盒[19]將廣泛用于新型植物露酒功能性評價。

3.2 抗菌活性

高乙醇體積分數(75%)的植物露酒本身具有一定的抗菌能力，但市售的植物露酒因考慮口感，一般將乙醇體積分數設為45%左右，使乙醇賦予植物露酒的抗菌能力有所不足。隨著對植物露酒中黃酮類物質研究越來越深入，得知黃酮類物質的抗菌活性可有效彌補植物露酒低乙醇濃度導致的抗菌能力不足，目前露酒中黃酮類物質抗菌研究已成為植物露酒功能性探索的重要組成部分。

到目前為止，已有研究表明沙苑子中含有大量的黃酮類物質，如沙苑子苷、紫云英苷、山奈酚等，具有一定的抗菌活性。范學輝等[24]利用沙苑子為原料，加入一定量的白砂糖，按照料液比為1∶60(g∶mL)進行沙苑子酒的研制，并采用濾紙片擴散法深入研究了該酒的抗菌活性，結果發現，沙苑子酒的抗菌活性來自該酒中的黃酮類化合物，其對葡萄球菌類(Staphylococcus)、芽胞桿菌類(Bacillus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)均有一定的抑制效果，但對紅葡萄酵母菌(Saccharomyces)的抑制能力較弱；其次，以紅葡萄酒酵母菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌為指示菌，研究溫度和金屬離子等外界因素對沙苑子酒抑菌活性的影響：隨著試驗體系溫度不斷上升，其對3種菌類的抑制作用呈逐級遞增趨勢(25～121 ℃)；Fe2+對3種菌類的輔助抑制能力顯著，Cu2+對大腸桿菌和枯草芽胞桿菌無輔助抑制作用，但對紅葡萄酵母菌有一定輔助抑制作用。尹明[25]發現，苦蕎蔓越莓果露酒對部分細菌類、霉菌類以及真菌類均有很強抑制作用，對釀酒酵母抑制圈直徑可達25 mm左右，隨著酒中的黃酮類化合物濃度不斷增加，抑菌能力就越強，即其抑菌能力與黃酮類物質濃度呈正相關。

植物露酒抗菌能力評價主要是通過觀察微生物抑菌圈直徑。抑菌圈法又稱擴散法，一種使用待測植物露酒酒樣在固體瓊脂培養基表面擴散，抑制周圍微生物生長并形成透明圓圈(即抑制區)的方法，主要包括濾紙片擴散法(Kirby-Bauer test，K-B法)、牛津杯法和打孔法[24-25](表3)，其中濾紙片擴散法和打孔法已經用于植物露酒抗菌活性評價，為植物露酒抗菌能力研究提供一定的參考價值。

表3 三種抑菌圈研究法的比較Table 3 Comparison of three methods of inhibition zone

3.3 抗癌活性

劉阿文等[21]發現，富含黃酮類化合物的植物露酒適量攝入能夠降低人類患癌的機率，其對癌癥的抑制機制主要表現在誘導癌細胞凋亡，干預核因子信號傳導，抑制癌細胞增殖、增強抑癌基因活性及抑制致癌物質代謝等方面[26]。VERMA等[27]在特定致癌物導致雌性大鼠患乳腺癌的試驗中發現，與對照組相比，當它們食用含有5%槲皮素的飲食時，腫瘤數量減少了50%，且能夠抑制耐藥基因活性表達，達到輔助抗癌效果。黃酮類化合物(槲皮素、山奈酚、芹菜素等)也是植物露酒的主要健康因子，其中山奈酚可抑制轉錄激活因子 (AP-1)活性，達到協助抗癌的目的；芹菜素能夠抑制蛋白質復合物(NF-κB)活性和環氧化酶(COX)活性，協助誘導癌細胞凋亡[28]。此外，黃酮類化合物還能抑制蛋白酪氨酸激酶(PTK)，抑制癌細胞、分裂，進而產生抗癌活性[29]。

近年來，關于植物露酒抗癌活性，相關學者展開了一系列研究。劉阿文等[21]以醬露酒(一種以植物大豆為原料加工而成的植物露酒)為研究對象，通過體外實驗對其抗癌活性進行研究，結果發現，醬露酒中不同黃酮類化合物含量對肝癌細胞HepG2和大腸癌細胞HT29的生長抑制作用有所不同，即醬露酒中黃酮類含量越高，對肝癌細胞HepG2和大腸癌細胞HT29的生長抑制率越強，在此研究中,50%醬露酒中黃酮類化合物含量最高可達(126.29±1.88)g/g，該酒對肝癌細胞HepG2生長抑制率最高可達(18.22±1.20)%，對大腸癌細胞HT29的生長抑制率最高可達(42.61±2.13)%，且不同酒精度的醬露酒對肝癌細胞HepG2和HT29的抑制率呈顯著性差異。此外，研究發現蟲草補酒和鶴齡春酒兩種露酒不僅風味獨特，且具有預防腫瘤的作用[30]。

目前植物露酒抗癌評價最常用的方法是體外抑制癌細胞增殖試驗[21]。

3.4 抗疲勞功能

隨著人們生活節奏的加快，人們的精神狀態持續處于緊繃狀態，身體疲憊不堪， 導致這種疲勞狀態的主要原因是以下的理論假設，包括能量大腦皮層神經保護理論、能量消耗理論、氧自由基-脂質過氧化理論和代謝物積累理論[31]。顯而易見，人之所以產生疲勞感，是因為身體得不到有效休息，進而破壞了機體本身恢復功能，造成亞健康的狀態，隨之各種慢性疲勞綜合癥(猝死、失眠、體虛等)給人類健康帶來威脅。

植物露酒中的活性成分具有抗疲勞的功能。劉敏等[32]發現五味子酒中黃酮類化合物含量最高，用不同含量的黃酮類化合物的五味子酒對小鼠進行灌胃實驗，五味子酒能明顯降低血液中的血尿素氮和血乳酸含量，表現為延長小鼠疲勞時間、減少跑步機電擊次數(反映出小鼠抗疲勞能力)，表明五味子酒可提高小鼠抗疲勞能力。方昊[33]以黃酒為酒基，以生曬參、甘草、桂花為原料，篩選出非發酵配伍的復合配方，制成復配植物露酒，并研究其抗疲勞能力，該復方露酒中黃酮類化合物與人參皂苷含量最高，且均具有抗疲勞能力。

疲勞會導致人體出現多種不良現象，如體重偏高或偏低，血尿素氮和血乳酸含量增加，肝糖原儲存能力下降等，已有研究根據上述不良現象總結了植物露酒抗疲勞評價方法，其主要是通過對小鼠進行露酒灌胃處理后，進行小鼠體重及其體內血尿素氮和血乳酸含量測定實驗、重游泳試驗、常壓抗缺氧試驗以及肝糖原含量測定實驗[33]，達到有效判定該植物露酒的抗疲勞能力的目的。

3.5 護肝功能

植物露酒主要成分是乙醇，其進入人體后，不到10%直接由肺、汗水、腎排出，剩余體內乙醇首先在肝臟中被氧化成乙醛，乙醛又在乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)的作用下生成乙酸，以此達到解酒目的，但是在解酒的同時，乙醇的中間產物乙醛也會對肝臟細胞產生毒害作用。而露酒中的黃酮類化合物能夠減輕乙醛對肝臟的損傷，進而達到保護肝臟的作用[34]。

在肝臟氧化代謝中主要起作用的是乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)、ALDH 途徑，其中ALDH酶是乙醛轉化成乙酸過程中的限制酶，該酶活性降低將影響乙醛轉化成乙酸的速率，使乙醛在肝臟細胞中大量累積，給肝臟帶來不可逆的迫害[34]。而植物露酒中的黃酮類物質能夠清除ALDH酶在醛氧化過程中產生的自由基和活性氧，增強ALDH酶的活性，進而加快了植物露酒中乙醇的氧化代謝。植物露酒不僅滿足了人們對酒精刺激感的追求，也達到了保護肝臟的效果，使植物露酒中黃酮類物質已經成為酒類研究中的一個熱點。大量黃酮類物質存在于苦蕎植物中，苦蕎植物露酒的浸提制備工藝能將大量黃酮物質帶入酒中，使該酒具有解酒護肝的作用[35]。

基于醉酒表現的研究，通過對小鼠灌胃試驗(模擬人體醉酒的行為)，測定小鼠醉酒率、醉酒耐受時間、醉睡時間，以及血清指標測定(谷草轉氨酶)和肝臟指標測定(丙二醛、超氧化物歧化酶)，明確植物露酒的護肝能力[35]。

3.6 降脂功效

植物露酒中黃酮類化合物可通過抑制與脂肪合成有關酶類(脂肪酸合酶)的活性，促進體內脂肪代謝，從而達到降脂目的。WU等[36]研究發現，富含黃酮類化合物的乙醇提取物可抑制脂肪酸合酶的活性，減少體內脂質物質的積累，達到降脂作用。其次，植物露酒中的槲皮素提取物在該方面具有同種功能。另外，ABDULLAHI等[37]發現黃酮類化合物刺激了某種肌肉細胞中的解偶聯蛋白，促進能量以非顫抖性產熱的方式被消耗，降低脂肪堆積。其次，植物露酒可阻礙機體脂肪的有效吸收，桑葚果中存在兩種新型的異黃酮，對胰脂肪酶有很強的抑制作用，削弱對攝入脂肪的分解力，減少腸道對脂肪分解產物的吸收，達到治療和預防過度肥胖的目的[38]，為桑葚類果露酒的市場化開發提供理論支撐。LIU等[39]發現原花青素除了阻礙脂肪吸收外，還具有調節腸道菌群的構成和活性的作用，并推測黃酮類化合物的降脂功能，并非某一黃酮類物質的單一作用，而是多種黃酮類化合物間的共同效應。荷葉露酒中含有槲皮素-3-丙酯和山奈酚等多種黃酮類化合物，能夠充分解釋荷葉露酒具有降脂等保健功能[11]。

馮丹[11]以荷葉營養保健酒為研究對象，擬用一定劑量的該露酒酒樣連續灌胃高血脂大鼠，通過測定小鼠的體重及血清中總膽固醇、總甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇等水平，評價該酒的降脂功效。

4 植物露酒中黃酮類化合物檢測分析技術

4.1 植物露酒總黃酮比色法分析技術

用于植物露酒總黃酮類化合物含量測定的分光光度計法，主要有硝酸鋁比色法、三氯化鋁-醋酸鉀比色法和直接紫外測定法(表4)。硝酸鋁比色法是2010年《中國藥典》頒布的方法，以蘆丁為對照品，與顯色劑形成紅色絡合物于波長500 nm處進行比色分析測定其含量；三氯化鋁-醋酸鉀比色法是根據上述方法改進而得；除上述兩種方法外，在《保健食品檢驗與評價技術規范》中采用的方法是直接紫外測定法，即樣品用聚酰胺粉吸附后，先用甲苯洗脫，再用甲醇洗脫黃酮類物質，于360 nm處測定其吸收值。

目前硝酸鋁比色法、三氯化鋁-醋酸鉀比色法是常用的分光光度計法，而直接紫外法需使用甲苯和甲醇等高毒試劑，且試劑用量較多，該方法使用較少[40]。

表4 植物露酒中總黃酮分析方法Table 4 Analysis method of total flavonoids in plant liqueur

4.2 植物露酒單體黃酮色譜法分析技術

色譜法是目前在單體黃酮檢測中最實用的分析方法之一，用于植物露酒黃酮類化合物的主要檢測方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、高效液相色譜法-串聯質譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)、超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS)；超臨界流體色譜法(supercritical fluid chromatography，SFC)(表5)。目前，HPLC是分析露酒中黃酮類化合物種類及含量最常用的色譜法，除具有測量范圍廣、靈敏度高、分離效果好等優點外，后期維護費用也相對較低，常用于科研工作者批量數據檢測，在減少了工作量的同時規避了人為因素造成的實驗誤差。

UPLC-MS多用于新型植物露酒中未知成分的定性定量分析，對開發植物露酒新品種有著重要意義。

表5 植物露酒單體黃酮色譜分析方法Table 5 Chromatographic analysis methods of flavonoids in plant liqueur

4.2.1 樣品前處理

由于植物露酒含有18%～45%的乙醇，黃酮類化合物又是醇溶性物質，因此通過對固相萃取凈化、QuEChERS 凈化(快速樣品前處理技術)以及直接稀釋進樣法進行回收試驗，黃酮類化合物回收率均在76.4%～103.5%，表明萃取等前處理手段的效果不大[42]。此外，超臨界二氧化碳萃取(supercritical fluid extraction，SFE)也不能提高黃酮類化合物的回收率[42]，目前，在植物露酒黃酮類化合物測定時可選擇直接稀釋進樣法。

4.2.2 液相色譜柱

承擔分離作用的色譜柱是液相系統的關鍵組成部分之一，使多組分樣品通過色譜柱分離為單一組分，從而進入檢測器進行定性或定量分析，分離效果直接關系到后續測定結果的準確性。液相色譜柱主要分為硅膠填充柱、聚合物填充柱和無機填充柱。用于酒類多組分檢測多為硅膠填充柱，可分為反相色譜柱、正相色譜柱和離子交換色譜柱。由于植物露酒黃酮類化合物組分復雜，為了進行有效組分分析，應選擇較長的反相色譜柱，例如Waters C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Luna C8(2)100A(150 mm×2 mm，3 μm)等，這類長柱雖然運行時間長，但針對植物露酒中結構類似物居多的黃酮類化合物具有較高分辨率。此外，植物露酒含有色素、多糖類、氨基酸類等干擾物質，一方面需采用對應的陰性露酒來配制基質曲線，以標準曲線和基質曲線的斜率之比考察基質效應的影響，另一方面進樣前需用0.22 μm有機濾膜過濾，防止色譜柱堵塞。

4.2.3 檢測器

黃酮類化合物由于其特殊結構，主要有兩個紫外吸收峰(Ⅰ型吸收峰在300～400 nm，Ⅱ型吸收峰在250～280 nm)，目前用于植物露酒黃酮類化合物測定所用檢測器主要有紫外吸收檢測器和二極管陣列檢測器，前者線性范圍廣、對溫度和流速不敏感，所測物質必須要有紫外吸收；后者是光學多通道檢測器，測定結果是光譜(定性)和色譜(定量)結合的三維圖譜，目前，廣泛用于植物露酒黃酮類化合物多組分定性定量分析[42]。

5 展望

植物露酒中黃酮類化合物的功能性研究和分析檢測技術已經取得了一定進展，抗氧化、抗癌、抗菌、抗疲勞、護肝等功能活性評價方法相對成熟，紫外分光光度法和色譜法在新型植物露酒黃酮類化合物含量測定中也得到廣泛應用，但隨著植物露酒行業的快速發展，酒中黃酮類化合物的其他功能特性和檢測技術手段將會被挖掘，仍有許多方面需要進行深入剖析和探究：

(1)黃酮類化合物的功能活性除本文闡述的幾種之外，還具有調節免疫力、抗過敏、抗病毒等活性，但目前在植物露酒中研究較少，也正是因為植物露酒產品功能性研究不充分，導致競爭力薄弱。因此，通過細胞試驗、動物試驗或臨床試驗對黃酮類化合物其他功能活性進行深入研究，對豐富植物露酒功能性具有重要意義。

(2)植物露酒相關研究主要集中在新品種露酒的開發，而露酒中黃酮類化合物等有效成分的穩定性探究相對較少，為提高植物露酒品質和利于露酒產品市場化，應加大對主要功能性因子穩定性的研究。

(3)目前，植物露酒中黃酮類化合物的檢測分析主要基于紫外分光光度計和液相色譜。但這兩種檢測手段只能用于露酒中黃酮類化合物階段性檢測，不能實時快速分析黃酮類化合物，更多用于實驗室檢測?？梢钥紤]將其他檢測方法(如紅外光光譜法)應用于植物露酒黃酮類化合物分析中，以期實現植物露酒中黃酮化合物的實時檢測。