不同強度運動對高脂飲食大鼠竇房結及心功能的保護作用

劉福泉，郝麗嬌，王 維，柳 凈，劉 尊，董珊珊

(1.滄州醫學高等?？茖W校健康管理與服務系，河北 滄州 061001；2.滄州市婦幼保健院手術室，河北 滄州 061001)

竇房結是心臟正常的起搏位點，對心功能起著重要的調節作用[1]。研究發現，長期高脂飲食可造成脂肪過度向心內浸潤，當脂肪浸潤到竇房結會使其結構功能發生變化，神經受損，動脈狹窄，影響心臟功能，嚴重時可致死亡[2]。有研究報道，通過長期有規律的有氧運動能夠降低體內脂肪含量[3]，但有關運動能否抑制脂肪向心臟浸潤鮮有報道?；诖?，本研究從竇房結組織形態變化、脂肪浸潤量及竇房結神經變化，探討不同強度運動對長期高脂飲食引發的不良心臟功能的保護作用，旨在為健身鍛煉提供科學的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，體質量(191.23±9.84)g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。大鼠于無特定病原級動物實驗室飼養，飲用雙蒸水，室溫為(23±2)℃，空氣濕度為40%～70%，分籠飼養，每籠 3只，共8籠。

1.2 試劑與儀器蛋白基因產物9.5(protein gene product 9.5,PGP 9.5)抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染液、油紅O染液購自南京建成生物工程研究所；Vevo2100型小動物彩色多普勒超聲診斷儀購自加拿大VisualSonics公司，石蠟包埋機、冰臺、石蠟切片機、攤片機、全自動組織脫水機購自德國萊卡公司，光學顯微鏡、彩色數碼CCD攝像頭購自德國麥克奧迪公司，電子天平購自上海天平儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組與處理將大鼠適應性飼養(國家標準顆粒型固體大鼠飼料)1周后，隨機分為A、B、C、D組，每組6只。A組大鼠給予普通飼料飼養；B組、C組和D組大鼠給予高脂飼料喂養，高脂飼料依據文獻報道[4]配制(質量分數):普通飼料 54.5%、蔗糖20.0%、蛋黃粉15.0%、豬油9.0%、膽固醇1.0%、膽酸鈉0.5%。C組大鼠給予高脂飼料喂養同時給予運動訓練，運動方法采用游泳訓練法[5-6]：水深為大鼠身體長度的2倍，水溫控制在(33±2)℃，每次放入水中3只大鼠，保證每只大鼠至少占有 0.05 m2的水面。實驗過程中為保持運動強度以小棍驅趕大鼠運動，每天確保在同一時間進行訓練。正式訓練前，第1周進行適應性游泳，每天逐漸增加游泳時間，第1周末游泳時間達到1 h；第2周開始正式實驗，每日60 min，每周6 d，持續訓練8周。D組大鼠給予高脂飼料喂養同時給予運動訓練，第1周適應性游泳訓練后，逐漸增加負重進行5%體質量負重游泳，其余運動訓練方法同C組，每日60 min，每周6 d，持續訓練8周。

1.3.2 大鼠心功能測試干預8周后，清除各組大鼠胸部毛發，使用體積分數2%異氟烷吸入麻醉，應用Vevo2100型小動物彩色多普勒超聲診斷儀測量大鼠左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVDS)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVDD)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVVS)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、左心室射血分數(left ventricular ejection fractions，LVEF)、左心室縮短分數(left ventricular shortening fraction，LVSF)。

1.3.3 大鼠竇房結取材及形態結構觀察末次游泳24 h后，各組大鼠用體積分數10%水合氯醛(0.04 mL·g-1)麻醉，取心臟，右心耳側朝上固定，以界溝為中心左右各5 mm平行剪開，上下腔靜脈處平行剪開，得一條形組織即為竇房結。取竇房結用體積分數95%的乙醇固定15 min，自來水沖洗1 min，蘇木精染色15 min，自來水沖洗1 min，伊紅染色35 s，自來水沖洗1 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察其形態結構。

1.3.4 油紅O染色法檢測大鼠竇房結脂肪細胞分布及含量采用油紅O染色法測量竇房結區脂肪細胞分布[7-8]：取竇房結組織，冰凍切片機切取15 μm 厚組織并貼于載玻片上，待組織恢復室溫，蒸餾水沖洗2 s，體積分數60%異丙醇浸洗2 s，油紅O染液浸染10 min，體積分數60%異丙醇浸染分色2 s；蒸餾水洗滌1 s，蘇木精復染2 min，自來水水洗10 min，蒸餾水沖洗 1 s，濾紙吸干水分，甘油封片，光鏡下觀察竇房結脂肪細胞分布，紅色為脂肪細胞，應用Image-Pro Plus軟件進行竇房結脂肪細胞染色陽性面積定量分析，計算整個視野內選定對象的面積總和[9-10]。

1.3.5 免疫組織化學法檢測大鼠竇房結神經標志物PGP 9.5表達應用ABC法進行免疫組織化學染色：取竇房結組織，使用全自動脫水機脫水、浸蠟、包埋，采用Leica石蠟切片機對組織蠟塊進行厚度為 5 μm 連續切片，每隔10張選1張，連續取4張，置于60 ℃ 恒溫干燥箱烘片1 h，乙醇脫蠟水化后將組織放入含有修復液的高壓鍋中加熱，有蒸汽冒出時開始計時3 min，修復完成后，自然冷卻至37 ℃左右，磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)反復清洗，滴加山羊血清，靜置20 min，滴加PGP 9.5 一抗，4 ℃過夜，PBS清洗，滴加二抗(SAB),PBS清洗，滴加DAB顯色劑，顯微鏡觀察，判斷顯色程度，自來水沖洗，蘇木精染色，溫水反藍，二甲苯透明，顯微鏡觀察，應用Image-Pro Plus軟件進行PGP 9.5染色陽性面積定量分析，計算整個視野內選定對象的面積總和[9-10]。

2 結果

2.1 4組大鼠心臟功能比較結果見表1。4組大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF、LVSF比較差異有統計學意義(F=6.840、6.698、4.884、15.333、17.293、41.025，P<0.05)。B組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著高于A組，SV、LVEF、LVSF顯著低于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。C組大鼠LVDS、LVDD、LVVS、SV、LVEF與A組比較差異無統計學意義(P>0.05);C組大鼠LVSF顯著高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。C組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著低于B組，SV、LVEF、LVSF顯著高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)。D組大鼠SV顯著低于A組，LVSF顯著高于A組，LVEF、LVSF顯著高于B組，SV顯著低于C組，差異有統計學意義(P<0.05)；D組大鼠其余心功能指標分別與A組、B組及C組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 4組大鼠心功能指標比較

2.2 4組大鼠竇房結組織結構變化結果見圖1。A組大鼠竇房結形態結構完整，細胞質豐富染色均勻，細胞間隙正常。B組大鼠竇房結結構缺失，細胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂。C組大鼠竇房結形態結構良好，細胞間隙均勻較窄，細胞質染色均勻。與C組相比，D組大鼠竇房結形態結構欠佳，細胞間隙略增寬。

圖1 4組大鼠竇房結組織結構(HE染色，×40)

2.3 4組大鼠竇房結區脂肪細胞分布及其含量比較結果見圖2。油紅O染色結果顯示，竇房結區脂肪細胞呈橘紅色，細胞核呈藍色。與A組相比，B組、C組、D組大鼠竇房結區均出現大面積脂肪浸潤，B組脂肪浸潤最為嚴重，D組次之，C組較輕。A組、B組、C組、D組大鼠竇房結區脂肪細胞表達量分別為(675.5±53.16)、(3 263.00±560.53)、(1 007.75±230.88)、(2 227.12±632.43)mm2。4組大鼠竇房結區脂肪細胞陽性表達量比較差異有統計學意義(F=29.657，P<0.05)。B組、C組、D組大鼠竇房結區脂肪細胞陽性表達量顯著高于A組，B組大鼠竇房結區脂肪細胞陽性表達量顯著高于C組和D組，D組大鼠竇房結區脂肪細胞陽性表達量顯著高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 4組大鼠竇房結區脂肪細胞染色結果(油紅O染色，×10)

2.4 4組大鼠竇房結區PGP9.5陽性表達及表達量的比較結果見圖3。PGP9.5免疫反應陽性細胞胞質呈棕灰色，神經組織多呈團塊狀。A組大鼠神經細胞最多且棕色較重，呈聚集狀；其次依次為C組、D組、B組，且棕色逐漸變淡。A組、B組、C組、D組大鼠竇房結區PGP9.5陽性表達量分別為(3 348.1±429.19)、(698.9±62.24)、(3 198.5±264.17)、(1 895.2±97.28)mm2。4組大鼠竇房結區PGP9.5陽性表達量比較差異有統計學意義(F=32.476，P<0.05)。A組大鼠竇房結區PGP9.5陽性表達量顯著高于B組和D組，C組和D組大鼠竇房結區PGP9.5陽性表達量顯著高于B組，C組大鼠竇房結區PGP9.5陽性表達量顯著高于D組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 4組大鼠竇房結組織PGP9.5表達(免疫組織化學，×10)

3 討論

脂肪組織是人體最大的旁分泌與內分泌器官，能夠分泌多種具有生物活性的脂肪細胞因子，其分泌的抵抗素、瘦素、內脂素、脂聯素等脂肪細胞因子可夠促進心肌細胞纖維化，嚴重影響心臟功能[11-13]。而心外膜脂肪組織是最靠近心臟的脂肪組織，包裹心臟表面的80%[14-15]，隨著年齡的增長，心外膜脂肪組織會逐漸向心臟內部浸潤，一旦波及竇房結，將嚴重影響竇房結起搏及傳導功能。長期高脂飲食可造成脂肪過度向心內浸潤，影響心臟功能。本研究結果顯示，B組大鼠心臟功能指標中LVDS、LVDD、LVVS顯著高于A組，SV、LVEF、LVSF顯著低于A組，與王全河等[16]和王維敏[17]研究結果相同，證實長期高脂飲食可導致心功能顯著下降。本研究結果顯示，與A組比較，B組大鼠竇房結結構缺失，細胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂；竇房結區出現大面積脂肪浸潤，脂肪細胞陽性表達量顯著增高，竇房結區PGP9.5陽性表達量顯著降低，說明長期高脂飲食加速了脂肪組織向心內浸潤，導致竇房結結構缺失，細胞間隙明顯增寬、肌纖維排列混亂，內部出現嚴重的脂肪浸潤，致使竇房結結構功能發生變化、神經受損、動脈狹窄等，從而影響心臟功能。

長期系統有規律的運動能夠改變心臟形態結構，并使其功能發生一系列的適應性變化，從而進一步增強心臟泵血功能。本研究結果顯示，與B組相比，C組、D組大鼠LVDS、LVDD、LVVS顯著低于H組，SV、EF顯著高于B組；D組大鼠僅LVSF顯著高于B組；D組大鼠心臟功能指標LVDS、LVDD、LVVS略高于C組，EF、LVSF略低于C組，但差異無統計學意義；D組大鼠SV顯著低于C組。這一結果說明，通過有規律的運動能夠抑制高脂飲食造成的心功能下降現象，且有氧運動對心功能改善的效果要好于高強度運動。運動可增加能量消耗，降低體內脂肪含量。馬伏英等[18]研究認為，有氧運動能夠調節脂肪代謝，減少脂肪堆積；BAE等[19]和劉子銘等[20]研究發現，有氧運動能夠降低體內脂肪含量；MATSUNAGE等[21]和CHIU等[22]研究發現，高強度運動能夠降低體內脂肪含量。本研究結果顯示，與B組相比，C組、D組大鼠脂肪浸潤現象顯著減輕，竇房結脂肪含量顯著降低；與C組相比，D組大鼠竇房結區脂肪含量顯著降低，D組大鼠竇房結形態結構欠佳，細胞間隙略增寬；這證實長期有規律的有氧運動能加速體內脂肪消耗，減輕體內脂肪過多堆積，阻止脂肪向竇房結的浸潤，且其效果好于高強度運動。

竇房結神經細胞數量直接影響竇房結搏動及傳導功能，進而影響心臟功能。有關運動對神經影響的研究已證實，有氧運動可以通過促使心內神經體積變大且數量增加來抵抗由于年齡增加導致的神經退行性變化[23]，有規律的運動能夠通過調節神經細胞因子的分泌及表達，調節神經遞質表達[24]；但長時間大強度運動可導致神經膠質細胞腫脹，且神經元細胞周圍空泡增多[25]。PGP9.5是神經標志物，其特異性染色為神經系統研究提供了高質量的技術，可特異性標志神經纖維及神經細胞，因此，本研究采用PGP9.5免疫組織化學來標記竇房結內部神經的變化，分析高脂飲食及運動對竇房結神經的影響。本研究結果顯示，C組和D組大鼠竇房結PGP9.5陽性表達量顯著高于B組，空泡程度減輕，說明有規律的運動消耗了體內脂肪，同時增加了細胞的抗氧化性，使竇房結神經損害得到改善；C組大鼠竇房結PGP9.5陽性表達量顯著高于D組，說明長期有規律的有氧運動更能有效抑制脂肪浸潤造成的竇房結神經纖維化、促使竇房結神經重塑。

綜上所述，長期有規律的有氧運動能夠顯著減輕高脂飲食引起的竇房結脂肪浸潤，促使竇房結神經重塑，維持正常竇房結組織結構及心臟功能。