激活轉錄因子 3對巨噬細胞M2型極化的影響及其機制

程 希，陳昭琳，黃 成，李 俊

(1.中國科學技術大學附屬第一醫院藥劑科，安徽 合肥 230002；2.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032)

巨噬細胞是天然免疫系統的重要組成細胞，同時也是維持自身代謝穩定的關鍵因素。巨噬細胞還具有在不同病理條件下分化異常的特點，稱之為巨噬細胞極化[1]。巨噬細胞在不同細胞因子的刺激下可極化為M1型和M2型 2 種不同的功能狀態。巨噬細胞可在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導激活下轉化為M1 型，同時可分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，iNOS)等促炎因子和趨化因子；M1型巨噬細胞通過分泌各類細胞因子來激活免疫應答，發揮抗原提呈細胞的作用，從而殺滅病原微生物，破壞腫瘤細胞等。M2 型巨噬細胞可由IL-4誘導活化，M2 型巨噬細胞可分泌精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和IL-10，主要與寄生蟲感染、組織重塑和腫瘤進展有關[2-3]。巨噬細胞的極化過程依賴于許多關鍵轉錄因子的調控，在不同疾病中，相關轉錄因子可直接或間接作用于目標基因的調控區域，調節促炎或抗炎細胞因子的表達，促進巨噬細胞功能表型極化。

激活轉錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是ATF/環磷酸腺苷的反應元件結合蛋白(ATF/cAMP-response element binding protein,ATF/CREB)家族的轉錄因子成員，通過其堿性亮氨酸拉鏈結構域與ATF/CREB 順式作用元件結合調控基因表達。有研究表明，ATF3是一種應激反應基因，可被一系列細胞應激信號誘導，通過抑制ATF3的表達和活性，改善非酒精性脂肪性肝炎病理過程中的胰島素抵抗、肝脂肪變性、炎癥和纖維化[4]。BAE等[5]研究發現，ATF3可能參與小檗堿的抗炎作用，小檗堿對ATF3 mRNA和蛋白表達的抑制作用呈濃度依賴性，同時其可以抑制LPS介導的炎癥相關因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達，當ATF3被敲除后，這種抑制作用也隨之消失。另有研究發現，從丹參中分離出的ST32da可誘導ATF3表達，下調脂肪因子基因表達水平，從而通過誘導脂肪細胞褐變來治療肥胖和相關代謝疾病[6]。信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activators of transcription,STATs)是一組廣泛表達于哺乳動物不同類型細胞和組織中的、能夠與目的基因調控區 DNA 結合的轉錄因子?；罨?STATs參與巨噬細胞極化，不同的細胞因子如干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、IL-4等活化STATs信號通路可產生不同的生物學應答。GLAL等[7]研究指出，ATF3可通過靶向調控上皮細胞中IL-22-pSTAT3信號和Th17細胞中的IL-6-pSTAT3信號來維持黏膜的穩態和免疫功能。目前，尚無關于ATF3是否可以通過STAT3來影響巨噬細胞極化方面的報道?；诖?，本研究探討ATF3是否可通過STAT3信號通路來調節巨噬細胞極化。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器小鼠來源的巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學技術大學生命科學院；高糖達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，IFN-γ、IL-4 購自英國Peprotech公司，ATF3小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)購自上海吉瑪技術有限公司，TRIzol Reagent RNA 提取試劑、LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen公司，ATF3、Arg-1抗體及反轉錄試劑盒購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，STAT3、磷酸化STAT3(phospho-STAT3，p-STAT3)抗體購自常州安博生物技術有限公司，β-actin抗體、二抗購自北京中山金橋生物技術公司，2 000 bp DNA marker、DNA上樣緩沖液購自日本TaKaRa公司；Pikoreal 定量聚合酶鏈反應儀購自北京九宇金泰生物技術有限公司，CO2培養箱NAPCO-6100購自美國杜邦公司，電泳儀、濕轉膜儀等Western blot實驗設備購自美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和分組將RAW264.7細胞接種于DMEM(含體積分數10 %胎牛血清及100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，于37 ℃ 含體積分數5% CO2的細胞培養箱中培養。待細胞融合達50 %～60%時，吹打下來傳代，按所需濃度接種至培養瓶、培養板。誘導分組：取對數生長期RAW264.7細胞，均勻接種至6孔板中，將細胞分為對照組、M1組、M2組；對照組細胞未做任何處理，M1組細胞用IFN-γ(10 μg·L-1)和LPS(10 μg·L-1)誘導6 h，M2組細胞用IL-4(15 μg·L-1)誘導48 h。收集各組細胞，置于-80°冰箱保存備用。轉染分組：將對數生長期RAW264.7細胞分為對照組、空白轉染組、M2對照組、M2 ATF3轉染組；對照組細胞未做任何處理，空白轉染組細胞轉染空白siRNA，M2對照組細胞用IL-4(15 μg·L-1)誘導48 h，M2 ATF3轉染組細胞用IL-4(15 μg·L-1)誘導48 h，然后轉染ATF3 siRNA序列。

1.2.2 ATF3 siRNA轉染RAW264.7細胞委托上海吉瑪公司設計合成ATF3 siRNA，序列如下：ATF3 siRNA上游引物序列為5′-CACCCUUUGUCAAGGAAGATT-3′,下游引物序列為5′-UCUUCCUUGACAAAGGGUGTT-3′;空白siRNA上游引物序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按照LipofectamineTM2000說明書用ATF3 siRNA 轉染RAW264.7細胞，采用通用型熒光標記的陰性對照siRNA進行轉染條件的優化。取對數生長期RAW264.7細胞，吹打均勻后，等體積接種于24孔板，用含體積分數10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM培養24 h，細胞貼壁后棄去舊培養液待轉染。siRNA與LipofectamineTM2000分別用適量不含血清和抗生素的DMEM稀釋，5 min內將其混合，室溫靜置20 min后加入24孔板中，然后置于培養箱常規培養6 h后熒光顯微鏡下觀察轉染情況。

1.2.3 定量反轉錄聚合酶鏈反應法檢測誘導分組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及轉染后各組RAW264.7細胞中ATF3、TGF-β、IL-10 mRNA的表達按TRIzol試劑說明書提取經處理后的RAW264.7細胞的總RNA，再立即用ND2000測定總RNA濃度。取1 μg RNA反轉錄得到cDNA后進行擴增，擴增反應體系20 μL，包括cDNA 2 μL、上下游引物各0.4 μL、sybrgreen 10 μL、Rox 0.4 μL、無酶水6.8 μL。引物序列由上海吉瑪公司設計合成。Arg-1上游引物序列為5′-TGACATCAACACTCCCCTGACAAC-3′,下游引物序列為5′-GCCTTTTCTTCCTTCCCAGCAG-3′；TGF-β上游引物序列為5′-CTCCACCTGCAAGAC-3′，下游引物序列為5′-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGA-3;IL-10上游引物序列為5′-GCTGCCTGCTCTTACTGACT-3′,下游引物序列為5′-CTGGGAAGTGGGTGCAGTTA-3′;β-actin上游引物序列為5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′,下游引物序列為5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。以內參β-actin的循環數作為對照，根據2-ΔΔCt計算ATF3、TGF-β、IL-10 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.2.4 Western blot 法檢測誘導分組RAW264.7細胞中ATF3、STAT3、p-STAT3蛋白及轉染后各組RAW264.7細胞中ATF3、Arg-1、STAT3、p-STAT3蛋白的表達取各組RAW264.7細胞用預冷的RIPA裂解緩沖液加苯甲基磺酰氟在冰上裂解60 min，每10 min振蕩1次，收集細胞裂解物，于4 ℃下13 000 r·min-1離心30 min，吸取上清液，蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白上樣量為30 μg，體積分數10%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，再轉移至聚偏氟乙烯膜上，非特異性封閉1 h，加入一抗，4 ℃過夜。次日用含辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，緩沖液洗膜4次，每次10 min，最后用化學發光法進行顯影。以 β-actin為內參，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 對照組、M1組、M2組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及ATF3、STAT3和p-STAT3蛋白的相對表達量比較結果見表1和圖1、圖2。M2組細胞中ATF3 mRNA及ATF3、p-STAT3蛋白相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；M1組與對照組細胞中ATF3 mRNA及ATF3、p-STAT3蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；M1組、M2組細胞中STAT3蛋白相對表達量與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 對照組、M1組、M2組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及ATF3、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達量比較

1：對照組；2：M1組；3：M2組。

1:對照組；2:M1組；3:M2組。

2.2 對照組、空白轉染組、M2對照組、M2 ATF3轉染組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及蛋白相對表達量比較結果見表2和圖3。M2對照組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及蛋白相對表達量均顯著高于對照組和空白轉染組，差異有統計學意義(P<0.05)；M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及蛋白相對表達量均顯著低于M2對照組，差異有統計學意義(P<0.05);其余各組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 對照組、空白轉染組、M2對照組、M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中ATF3 mRNA及蛋白相對表達量比較

1：對照組；2：空白轉染組；3：M2對照組；4：M2 ATF3 轉染組。

2.3 對照組、空白轉染組、M2對照組、M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中Arg-1、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達量比較結果見表3和圖4、圖5。M2對照組RAW264.7細胞中Arg-1、p-STAT3蛋白相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05);M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中Arg-1、p-STAT3蛋白相對表達量均顯著低于M2對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。其余各組RAW264.7細胞中Arg-1、STAT3及p-STAT3蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表3 對照組、空白轉染組、M2對照組、M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中Arg-1、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較

1：對照組；2：空白轉染組；3：M2對照組；4：M2 ATF3 轉染組。

1：對照組；2：空白轉染組；3：M2對照組；4：M2 ATF3轉染組。

2.4 對照組、空白轉染組、M2對照組、M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中IL-10、TGF-β mRNA相對表達量比較結果見表4。M2對照組RAW264.7細胞中IL-10、TGF-β mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05);M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中IL-10、TGF-β mRNA相對表達量均顯著低于M2對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。其余各組RAW264.7細胞中IL-10、TGF-β mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表4 對照組、空白轉染組、M2對照組、M2 ATF3 轉染組RAW264.7細胞中 IL-10、TGF-β mRNA相對表達量比較

3 討論

巨噬細胞是機體免疫細胞的一種，參與機體生長發育、穩態調控及免疫反應等重要過程，尤其在機體炎癥調控過程中發揮重要作用。巨噬細胞根據環境變化(例如微生物產物、損壞應答細胞，活化的淋巴細胞等)調整其表型和功能。巨噬細胞被不同因素激活后，分為2種極性分化類型，一種為經典激活 M1 型巨噬細胞，另一種為替代激活M2 型巨噬細胞[8]。巨噬細胞的替代性激活在炎癥反應、寄生蟲感染、過敏反應、傷口愈合、腫瘤發生與發展及代謝穩態中有重要作用。因此，了解巨噬細胞極化過程的分子機制，有助于通過調控巨噬細胞功能來干預病理過程。

轉錄因子ATF/CREB家族成員ATF3作為應激反應、免疫反應的早期調節因子，在維持機體調節免疫狀態及代謝穩態過程中起到了非常重要的作用。在急性腎損傷中，ATF3可以通過抑制促炎因子IL-6和IL-12表達、Toll樣受體激活、細胞凋亡這3種途徑發揮對腎臟的保護作用，也可以作為生物標志物，為急性腎損傷診斷、預后評估提供參考[9]。另有研究顯示，ATF3可通過參與阻止Ⅱ型肺泡上皮細胞內質網應激的過程來改善肺纖維化[10]；提示ATF3在相關疾病的發生、發展中起到了重要作用。本研究通過在RAW264.7細胞上建立M1和M2型巨噬細胞的模型，來研究ATF3在巨噬細胞極化中的作用，結果發現，ATF3在M2型巨噬細胞中高表達，表明其可能參與了巨噬細胞M2型的極化。為進一步了解其在M2型巨噬細胞極化中的調控機制，將ATF3 siRNA轉染入細胞中，結果顯示，當沉默ATF3后，M2型標志蛋白Arg-1表達水平明顯降低，同時M2型標記的細胞因子TGF-β、IL-10表達水平也明顯下降，說明ATF3表達水平的降低抑制了巨噬細胞向M2型的極化。在炎癥性腸病中，通過ToxoROP16I/III體外誘導巨噬細胞RAW264.7發現，M2型標志蛋白Arg-1、IL-10和TGF-β1表達水平增加，p-STAT3和p-STAT 6表達水平也升高[11]；此外，來自膀胱癌細胞的miR-21外泌體抑制了巨噬細胞中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路的磷酸酶和緊張素同源物的激活，并增強了STAT3的表達，促進了向M2型的極化[12]。本研究中，在M2型巨噬細胞中，STAT3的磷酸化水平明顯升高，提示STAT3信號通路參與了巨噬細胞M2型極化過程，與相關文獻[13]報道一致；當ATF3被沉默后，細胞中STAT3磷酸化蛋白水平明顯降低，提示ATF3可能通過激活STAT3信號通路來調節巨噬細胞向M2型的極化。

巨噬細胞種類豐富，且在整個腫瘤進展過程中起重要作用，腫瘤微環境中的腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM)可分化為不同的功能表型。M1型被定義為參與殺傷癌細胞的促炎細胞，M2型可特異性促進腫瘤細胞生長轉移、組織重塑和免疫抑制[14]。Wilms′ 腫瘤中TAM密度較高，M2型巨噬細胞密度隨腫瘤進展而增加，提示患者預后較差[15]。本研究中，ATF3通過STAT3信號通路影響巨噬細胞向M2型極化，但其是否可作為一個影響TAM的靶點，從而給腫瘤的治療帶來新的契機，尚需要進一步的研究。