海藻酸鹽/分離乳清蛋白/海藻糖復合保護劑提高益生菌活力探究

◎ 萬 欣，周 勇，盧宗梅，邴狄祥，郭世堂，葉 震，何 珣，陳可泉

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816；2.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233000）

植物乳桿菌常被加工成益生菌劑，預防和治療胃腸道疾病，如腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎和腹瀉病[1]。在益生菌劑的制備過程中，植物乳桿菌通常通過冷凍干燥被干燥成粉末，而冷凍干燥會花費大量的時間和精力。與冷凍干燥相比，噴霧干燥時間更短、能耗更低、成本更低，更適合工業化生產[2]。益生菌劑在噴霧干燥過程中，高溫干燥脫水會降低益生菌的活力。高溫會破壞蛋白質、核酸等大分子物質的結構，破壞單體單元之間的連接，最終導致單體單元的破壞。干脫水會改變細胞質膜的流動性和物理狀態，導致代謝活動降低[3-4]。不利的環境條件，如酸、熱、壓力和氧氣，也將導致益生菌的細胞活力顯著下降[5]。保護劑在保護益生菌免受不利條件影響，以及干燥后長時間儲存方面起著至關重要的作用[5]。乳清蛋白（WP）是奶酪生產過程中的副產品，占乳蛋白總量的20%，具有出色的膠凝和成膜特性[6]。植物乳桿菌用乳清蛋白和支鏈淀粉包埋，噴霧干燥獲得的活菌數可以達到7.24 log CFU·g-1[7]。本文以海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖為保護劑，提高噴霧干燥后植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌數，優化保護劑配比和噴霧干燥參數。此外，在儲存過程中評估了菌劑的最佳儲存溫度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013，由中糧生物科技股份有限公司提供；分離乳清蛋白，購自南京通盈生物科技有限公司；其他化學品，均為國藥分析級試劑。

1.2 植物乳桿菌懸浮液的制備

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013接種于MRS培養基中，37 ℃條件下培養18 h；通過在3 000 r·min-1條件下離心10 min、4 ℃收集細胞并用無菌氯化鈉溶液0.85%（w/v）洗滌兩次。通過將細胞重懸在氯化鈉溶液中并在4 ℃下儲存，獲得細胞懸浮液。

1.3 保護劑的制備及噴霧干燥工藝

將海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖用蒸餾水溶解制備保護劑溶液，并優化配比。在室溫下將保護劑與Lactobacillus plantarumCGMCC 15013懸浮液混合?；旌先芤和ㄟ^噴霧干燥器（SD-1500，Triowin，上海，中國）進行噴霧干燥。優化了Lactobacillus plantarumCGMCC 15013與保護劑的比例、進氣溫度和進料流速。最后，收集干燥的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013發酵劑。

1.4 保護劑配比優化

1.4.1 單因素測試

進行單因素檢驗主要是為了評估海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖對Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌數的影響，并確定它們適用于響應面法（RSM）的范圍。在此過程中，Lactobacillus plantarumCGMCC 15013與保護劑的比例為1∶1（v∶v），進料流速為300 mL·h-1，進風溫度為120 ℃。

1.4.2 Box-Behnken 實驗設計

海藻酸鹽（A）、分離乳清蛋白（B）、海藻糖（C）、蔗糖（D）的最佳范圍是基于單因素測試確定的?；?個水平的4個主要因素的Box-Behnken設計用于探索保護劑的最佳比例以及這些變量的相互作用。整個設計包括29個實驗，3個重復。因子及水平見表1。實驗設計、圖形構建和結果分析由Design of Expert（DOE Version 8.5, StatEase. Inc, Minneapolis,MN. USA）進行。計算回歸方程，分析等高線圖和3D曲面圖，得到各變量的最優值。

表1 Box-Behnken 實驗設計參數表（單位：g·L-1）

1.5 噴霧干燥參數優化

1.5.1 單因素測試

進行單因素試驗主要是為了評估細菌與保護劑的比例、進料流量，以及植物乳桿菌活菌數的入口空氣溫度，并確定其適合正交試驗的范圍。保護劑由25.3 g·L-1海藻酸鹽、87.8 g·L-1分離乳清蛋白、15.9 g·L-1海藻糖和150.3 g·L-1蔗糖組成。

1.5.2 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定了細菌與保護劑的比例（A）、進料流速（B）和溫度（C）的最佳范圍。形成4因素3水平正交試驗以優化噴霧干燥參數。表2顯示了正交試驗參數。每個處理一式3份進行。

表2 正交試驗中的因素和水平表

1.6 發酵劑中植物乳桿菌的存活率

噴霧干燥前后植物乳桿菌的活菌數通過平板菌落計數法一式3份測定。將1.0 gLactobacillus plantarumCGMCC 15013溶解在9 mL檸檬酸三鈉溶液（3%，w/v）中，將懸浮液用0.85%鹽水溶液連續稀釋10倍，并涂在MRS瓊脂上。計數前將平板在37 ℃孵育48 h。

1.7 儲存期間植物乳桿菌在發酵劑中的生存力

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃下可保存120 d，計算植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌數。所有實驗一式3份進行，結果表示為平均值±標準差。使用SPSS 16.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）來分析統計顯著性。當p＜0.05時，假設有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 保護劑配比優化

保護劑比例采用Box-Behnken設計進行分析。在這項研究中，海藻酸鹽（A）、分離乳清蛋白（B）、海藻糖（C）、蔗糖（D）的不同組合進行了29次，每個實驗一式3份進行，結果如表3所示。通過軟件分析得到基于實驗因素的回歸方程如下：

表3 保護劑的方差分析表（ANOVA）

模型的F值為31.70，p＜0.000 1，表明模型穩定且具有統計學意義。同樣地，報告了A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2和D2。修正系數R2計算為0.938 8，通過實驗參數及其相互作用來解釋響應值的變異性，暗示該模型可以解釋93.88%的變異。本實驗得到的調整系數R2與相關系數R2的差異在邏輯上是可以接受的。因此，該模型適用于分析和預測保護劑的最佳配比。

2.2 響應曲面和等高線圖

在研究中，使用海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作為植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的噴霧干燥保護劑，并通過RSM優化它們的比例，見圖1。

圖1 響應曲面和等高線圖

響應曲面圖的曲線特性顯示了變量和響應值之間的相互作用[8]。圖1（a）中的橢圓形顯示了海藻酸鹽、分離乳清蛋白對提高植物乳桿菌細胞活力的顯著影響。在低濃度下，活菌數隨著海藻酸鹽、分離乳清蛋白的加入而增加；圖1（b）顯示了海藻酸鹽、海藻糖之間的顯著相互作用；圖1（c）中的橢圓形狀顯示了分離乳清蛋白和蔗糖在響應值方面的顯著相互作用。隨著分離乳清蛋白和蔗糖濃度的增加，植物乳桿菌的活菌數增加，還發現海藻糖和蔗糖之間的相互作用提高了菌活力，如圖1（d）所示。分離乳清蛋白與海藻糖、海藻酸鹽與蔗糖之間的相互作用分別如圖1中（e）、（f）所示。

海藻糖具有穩定的功效和優異的加工性能，可在干燥過程中用作賦形劑以穩定蛋白質結構。海藻糖具有高玻璃化轉變溫度，可以通過形成玻璃結構來限制分子間的相互作用[8]。此外，海藻糖可以被作為益生元來提高微生物細胞對不利環境條件的適應性，提高微生物細胞存活率[9]。研究表明，海藻糖是一種極好的噴霧干燥保護劑。在噴霧干燥過程中，水分的流失會導致植物乳桿菌的活菌數顯著減少。此外，研究表明蔗糖還可以防止環境對微生物細胞膜的不可逆損傷[10]。

2.3 最佳條件的確定和驗證

根據RSM，海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和 蔗 糖 分別為39.09 g·L-1、88.56 g·L-1、14.01 g·L-1和127.70 g·L-1，作為最佳噴霧干燥保護劑的最理想濃度，在這些預測條件下，植物乳桿菌的活菌率為75.68%。為了驗證優化的工藝參數，基于建議的模型進行了3個驗證實驗，植物乳桿菌的活菌率為75.11%。3個試驗的實驗平均值與預測值非常吻合，它們的差異在可接受的范圍內。本文較高的活菌率表明植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013受到海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作為保護劑的有效保護。

2.4 噴霧干燥參數優化

設計微生物細胞與保護劑比例分別為2∶1、3∶1和4∶1（v∶v），進料流速分別為210 mL·h-1、240 mL·h-1和300 mL·h-1，進風溫度分別為110 ℃、115 ℃和120 ℃，進行正交試驗。正交試驗用于優化噴霧干燥參數。通過正交L9(34)測試設計評估了3個因素，如表4所示。結果表明，這些因素對植物乳桿菌活菌數的影響程度依次為：溫度（C）＞微生物細胞與保護劑的比例（A）＞進料流速（B）。由均值分析可知，理論最佳噴霧干燥植物乳桿菌活菌數的參數是細菌與保護劑的比例3∶1（v∶v），進料流速240 mL·h-1，進氣溫度115 ℃（A2B2C2）。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活 菌 數 為9.24 log CFU·g-1（活 菌 率78.12%），含水量為4.33%?；罹鷶敌∮谡辉囼炞罴褏礎2B1C2的9.38 log CFU·g-1（活菌率79.28%），因此確定實際最佳噴霧干燥參數為細菌與保護劑的比例3∶1（v∶v），進料流量 200 mL·h-1，進風溫度115 ℃。本研究中使用的保護劑比例和噴霧干燥工藝參數可以保護植物乳桿菌更好。

表4 正交試驗的結果和分析表

2.5 植物乳桿菌儲存期間的穩定性

微生物菌劑的儲存期主要由儲存溫度決定。在低溫下，微生物細胞更易于保持活性。本研究中，植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃的貯藏條件下，活菌數隨時間延長而下降，見圖2。不同的儲存溫度之間存在顯著差異。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃貯藏時，生存力受到最嚴重的損害。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃下90 d后完全喪失生存力。在-20 ℃和4 ℃下保存120 d后，活菌數分別為8.38 log CFU·g-1和6.66 log CFU·g-1，-20 ℃為植物乳桿菌菌劑的最適保存溫度。

圖2 植物乳桿菌Lactobacillus plantarum CGMCC 15013在儲存期間的活菌數量變化圖

3 結論

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的最佳保護劑配比為39.09 g·L-1海藻酸鹽、88.56 g·L-1分離乳清蛋白、14.01 g·L-1海藻糖和127.70 g·L-1蔗糖。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013菌劑的最佳噴霧干燥參數為細菌與保護劑的比例3∶1（v∶v），進料流速200 mL·h-1，進風溫度115 ℃，植物乳桿菌最大活菌數9.38 log（CFU·g-1），活菌率79.28%。植物乳桿菌發酵劑在-20 ℃下儲存120 d后，發酵劑中植物乳桿菌的活菌數為8.38 log CFU·g-1。本研究為噴霧干燥貯藏后的植物乳桿菌提供了一種新的保護劑配方，具有很好的保護作用。該保護劑對益生菌劑生產具有重要意義。