遺傳改造乳酸鏈球菌合成Nisin的研究進展

羅林根，穰 杰，夏立秋*

(1.湖南師范大學生命科學學院，中國 長沙 410081；2.臨湘市第一中學，中國 岳陽 414000)

乳酸鏈球菌素( Nisin)是由乳酸鏈球菌產生的一類小分子肽，具有廣譜抑菌作用，不僅對致病性病原體如李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、芽胞桿菌等革蘭氏陽性菌具有抗菌活性，還能緩解由部分微生物引起的食品腐敗變質問題。由于Nisin具有抑菌效果好、熱穩定性高以及對人安全無毒等優點，早在1969年就被世界衛生組織(WHO) 批準用作食品防腐劑，隨后于1988年被美國食品藥品監管局(Food Drug Administration,FDA)列入GRAS (一般認為安全) 名單。目前，Nisin作為一種國際公認的安全無毒的天然防腐劑，已被商業化廣泛應用[1]。

Nisin的分子結構已于1971年得到解析，其分子式為C143H228N42O37S7，相對分子質量為3 500，一般以二聚體(7 000)或四聚體(14 000)結構存在。Nisin主體結構由34個氨基酸殘基構成，并通過硫醚鍵連接成五環結構，共涉及11種常見氨基酸和4種稀有氨基酸。在此基礎上，通過氨基酸修飾可產生不同Nisin變體。目前，已有8種天然Nisin變體(Nisin A，Nisin Z，Nisin F，Nisin Q， Nisin H，Nisin P，Nisin U和Nisin U2)被報道，其中Nisin A和Nisin Z研究最為廣泛[2]。

Nisin作為一種無毒的天然防腐劑，需求量一直持續增長，然而由乳酸鏈球菌生產的Nisin存在發酵活力、產量較低以及生產成本高等問題，嚴重限制它的商業化推廣應用。發酵培養基優化是促進乳酸鏈球菌合成Nisin的重要手段。吳疆等根據代謝發酵控制原理，采用二次回歸正交旋轉組合設計，研究了乳酸鏈球菌搖瓶發酵培養基中蔗糖、蛋白胨、酵母浸出物以及KH2PO3等4種主要成分對Nisin產量的影響，通過DPS軟件優化其添加比例，顯著提高Nisin的產量[3]。通過培養基優化雖然能促進Nisin的合成，但其產量遠沒有達到工業化生產要求。目前，對參與目標天然產物生物合成的相關基因進行定向遺傳改造或代謝途徑優化是促進其生物合成的主要方法，并在許多重要天然產物生產菌中廣泛應用。

1 乳酸鏈球菌基因組特征

近年來，利用全基因組測序與生物信息學方法對乳酸鏈球菌進行遺傳背景的解析為乳酸鏈球菌的進一步開發提供了廣闊的研究空間。自Bolotin等[4]在2001年發布了第一株名為乳酸鏈球菌乳酸亞種IL1403菌株的全基因組序列以來，總共有235株乳酸鏈球菌及其亞種的全基因組完成圖或草圖得到公布，基因組大小在1.71～2.96 Mb，GC含量在34.5%～38.6%[5-7](表1)。以乳酸鏈球菌乳酸亞種IL1403為例，該菌株基因

表1 部分已完成測序的乳酸鏈球菌基因組信息比較

組大小為2.37 Mb，GC含量為35.3%，共編碼2 219個蛋白質，19個rRNA，63個tRNA以及其他4個非編碼RNA。對所編碼蛋白質的生物學功能進行分析，發現該菌株含有全部20種氨基酸的生物合成途徑[4]。在對已測序的乳酸鏈球菌基因組進一步分析發現，部分菌株還存在多個質粒，如乳酸鏈球菌乳酸亞種KF147的基因組由一條染色體DNA和1個質粒組成[8]，而乳酸鏈球菌乳酸亞種SD96的質粒數目達到了10個[9]，從而賦予不同乳酸鏈球菌亞種獨特的生物學功能。此外在乳酸鏈球菌基因組中還存在多個前噬菌體序列和插入序列，如乳酸鏈球菌乳酸亞種MG1363的基因組存在多達134 kb前噬菌體序列和92個插入序列[10]。這些序列的存在可引起高頻率的基因水平轉移，這可能是乳酸鏈球菌在適應復雜的營養環境過程中，導致染色體大小發生變化的重要原因。

2 Nisin生物合成基因簇及合成途徑

全基因組測序結果顯示，在乳酸鏈球菌基因組中存在一個大小為14 kb的基因簇nisABTCIPRKFEG，并已證明這11個基因都參與了Nisin的合成[11](圖1A)。其中nisA編碼了含有57個氨基酸殘基的Nisin前體肽，隨后Nisin前體肽中的絲氨酸和蘇氨酸在脫水酶NisB和環化酶NisC的催化下脫水生成Dha和Dhb殘基并與半胱氨酸偶聯，形成甲基羊毛硫氨酸環[12](圖1B)。完全修飾的Nisin前體在轉運蛋白NisT(屬于ABC轉運蛋白家族)的作用下可以跨膜運輸到細胞外，同時在胞外蛋白酶NisP的作用下對Nisin前體進行前導肽的切割最終形成成熟且有活性的抗菌肽[13]。由于Nisin具有強烈的抑菌性，在長期進化過程中乳酸鏈球菌產生了一種自我保護的機制，如在脂蛋白NisI和ABC轉運蛋白NisFEG的協同作用下，一方面通過直接結合Nisin，防止其與脂質體Ⅱ分子結合在細胞膜上形成小孔，另一方面，ABC 轉運蛋白 NisFEG能夠把入侵細胞膜的Nisin分子排出到細胞外，減少進入細胞膜的Nisin分子數量，從而防止Nisin分子局部濃度過高形成孔洞等，避免自身受Nisin的侵害[14]。另外，該基因簇中還存在調控Nisin合成的蛋白，如NisR和NisK。當細胞外出現成熟的Nisin分子時，它會與NisK結合，引發該蛋白組氨酸磷酸化，并將磷酸基團轉移至NisR上使其磷酸化，最終激活nis基因簇上相應基因的轉錄調控[15]。

圖1 Nisin生物合成基因簇及其編碼產物(A.nis基因簇結構及其啟動子位置示意圖；B. Nisin結構)

3 代謝工程改造促進乳酸鏈球菌Nisin的合成

與培養基優化相比，代謝工程定向改造在提高菌株次生代謝產物合成能力上具有更強的目的性。在改造策略上可以選擇對目標次生代謝產物進行基因簇多拷貝、正調控基因過表達、負調控基因阻斷以及優勢基因異源表達等。

3.1 增加Nisin基因簇中關鍵基因的拷貝數

研究發現增加直接參與Nisin生物合成基因的拷貝數可促進Nisin的產量，增加參與Nisin生物合成調控與抗性基因的拷貝數(nisRK和nisFEG)，也可達到相同的效果[16]。雖然Nisin在其自身的生物合成中是作為誘導劑發揮作用，但乳酸鏈球菌的正常生長卻受到了Nisin的不利影響。特別是在發酵的后期，生長培養基中大量Nisin的積累會對乳酸鏈球菌產生反饋抑制作用。由于乳酸鏈球菌可通過產生脂蛋白NisI和轉運蛋白NisFEG來保護自己，因此，通過增加乳酸鏈球菌中Nisin耐藥基因(nisI和nisFEG)的表達，可使細胞對Nisin的耐藥性增強，從而避免自身受Nisin的影響[17]。Stein等人將含有nisI的重組載體導入野生型乳酸鏈球菌后，使得Nisin的產量提高20%，同時，nisI拷貝數的增加還促使nis基因簇中其它基因的表達量增強[14]。有研究人員在對乳酸鏈球菌乳酸亞種164菌株進行遺傳操作時，通過對結構基因nisZ、調控基因nisRK和抗性基因nisFEG進行共表達，使得Nisin Z的活性由16 000 AU·mL-1增強到25 000 AU·mL-1[18]。在其他的研究中發現，同時提高nisRK和nisFEG的拷貝數，可使Nisin的產量提高45%[19]。

3.2 提高乳酸鏈球菌對低pH值發酵液的耐受性

由于乳酸鏈球菌在發酵過程中會產生乳酸，導致發酵液pH值會逐漸降低，使得細胞出現自溶或釋放蛋白酶，進而抑制Nisin產量，因此提高菌株對乳酸的耐受性對提高其產量有促進作用[20]。解決這個問題的關鍵是克隆和表達丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因，以促進乳酸鏈球菌將碳水化合物代謝生成乙醇。Wardani等人的研究結果顯示，通過相應修飾可使Nisin的產量提高1.7倍[21]。同時有研究發現通過增加天冬酰胺合成酶基因的拷貝數來提高乳酸鏈球菌細胞壁組成中D-Asp酰胺化的比例，可使重組菌株對環境中酸性條件的耐受性明顯提高，從而提高Nisin的產量。在分批發酵和補料分批發酵中，重組菌株F44A的Nisin產量分別提高到3 405 IU·mL-1和5 346 IU·mL-1[22]。此外，Zhang等將17個與耐酸相關的基因在乳酸鏈球菌F44中進行異源表達或過表達來維持細胞內最佳pH值。其中，過表達hdeAB，ldh和murG基因的工程菌株在發酵過程中，菌株的耐酸能力顯著提高，細胞內pH值更穩定且Nisin產量提高到5 560 IU·mL-1[23]。

3.3 提高乳酸鏈球菌整體代謝能力

一般而言，Nisin的產量取決于發酵過程中乳酸鏈球菌的生物量，高濃度、高活性生產細胞的存在可顯著促進目標代謝產物的合成。因此，有許多研究旨在增加發酵條件下的乳酸鏈球菌基礎代謝能力，從而獲得生產性能高的工程菌。如Papagianni等人[24]將黑曲霉中與能量代謝相關的aox1基因在乳酸鏈球菌中進行異源表達，使細胞產生更多的能量，加速細胞分裂和代謝，最終使菌株生物量由3.2 g·L-1提高到5.8 g·L-1，Nisin的產量由5 900 IU·mL-1增加到7 900 IU·mL-1。他們又將pfk13-pkaC-aox1基因同時在乳酸鏈球菌中進行表達，通過提高菌株對發酵液中碳源的利用和能量生成，使得菌株生物量達到7.5 g·L-1，Nisin活性達到14 000 IU·mL-1。除上述研究來促進Nisin的合成外，有研究人員還借助基因組重排技術來提高Nisin產量，所獲得的突變株F44能耐受高濃度的葡萄糖(8%～15%)和Nisin (5 000～14 000 IU·mL-1)，最終使突變株Nisin的產量提高了2.4倍[25]。

4 合成生物學技術在改造乳酸鏈球菌合成Nisin中的策略

單個基因修飾在一定程度上能夠促進目標次生代謝產物生物合成，但次生代謝產物合成途徑通常相對復雜，受到多個代謝途徑和轉錄因子共同控制。通過對單個基因進行修飾可能只會增加部分酶的表達量，對整個代謝途徑的影響不明顯，甚至中間產物的過度積累有時可能會對Nisin生物合成起抑制作用，導致難以按照確定的目標進行設計或設計的系統不穩定，因此，亟需采用新的遺傳改造策略來提高Nisin的產量。近年來，合成生物學的興起和發展使得對微生物進行遺傳改造進入到一個全新的階段，研究主流也從單一基因的設計擴展到對多個代謝途徑進行改造。通過深度挖掘高效功能元件，重構代謝網絡，優化元件與底盤的適配性，并對代謝網絡流量進行精細調控，從而構建基于人工基因線路的定制化細胞來實現藥物與功能材料或目的化合物的大規模生產及應用[26]。

4.1 優勢底盤細胞構建

在特定環境中，維持細菌正常代謝所需的必需基因構成了該菌株的最小基因組。采用最小基因組作為底盤微生物進行目標產物的合成，可減少本底其他不必要的代謝路徑對底物、能量和還原力的消耗。已公布的微生物全基因組測序結果顯示，基因組中存在大量的編碼非目標產物的基因簇、前噬菌體序列、轉座酶和插入序列等，這些基因元件的存在很可能干擾目標產物的合成與檢測，同時導致菌株遺傳物質不穩定[27]。因此優勢底盤細胞的開發最重要的策略就是對目標菌株進行基因組精簡和優化，并在很多微生物合成生物學改造中得到了廣泛應用。如枯草芽胞桿菌PG10與野生型枯草芽胞桿菌相比，其基因組已縮減36%，但該突變株克服了與分泌過程和分泌產物不穩定性有關的蛋白質生產的幾個瓶頸，顯著提高細菌表達宿主分泌蛋白的產量[28]。研究發現慢病毒在大腸桿菌中進行克隆時往往表現出極大的不穩定性，導致難以獲得有效的克隆，Chakiath等人[29]對大腸桿菌基因組進行縮減后，有效地促進了慢病毒表達載體在細胞內的重組穩定性。Zhou等人[30]敲除了天藍色鏈霉菌體內所有的10個PKS，NRPS基因簇以及900 kb的端粒序列，并在該底盤內實現了放線紫紅素的過表達。已公布的乳酸鏈球菌全基因組測序結果顯示，其基因組不僅存在一定的可塑性(1.71～2.96 Mb)，還包括多個非必須基因區域、前噬菌體序列和插入序列等，對其進行精減，可極大減少本底非必須代謝途徑對底物、能量和還原力的消耗以及維持菌株的遺傳穩定，從而顯著促進Nisin的合成。

4.2 前體合成途徑優化

目標產物在宿主細胞中合成不足，很有可能是由于宿主內某些底物或前體供應不足?？梢酝ㄟ^組合生物合成的方法對宿主菌代謝途徑進行改造和優化，以滿足目標產物合成所需底物和前體的供應。如果通過基因組精簡來敲除和沉默原有基因簇的手段是“節流”，那么通過改造和優化代謝途徑來增加底物和前體含量的方法可稱之為“開源”，這種方法需要對宿主菌的整個代謝網絡有比較深入的了解，才能夠進行合理的改造。孫偉康等人[31]基于基因組功能注釋和比較基因組學構建了乳酸鏈球菌的首個基因組規模代謝網絡模型，該模型共涉及557個基因，668個代謝物，840個反應，并進一步在定性和定量兩個層次驗證了模型的準確性，較為全面地揭示了乳酸鏈球菌的代謝特點，為乳酸鏈球菌的前體合成途徑改造和優化提供了良好的工具?；贜isin的結構解析可知，其生物合成至少涉及14種常見氨基酸和4種稀有氨基酸。結合基因組規模代謝網絡模型，可將涉及上述氨酸酸合成的代謝通路增強、競爭性代謝通路阻斷等來優化前體合成途徑，從而提高Nisin的合成能力。

5 總結與展望

Nisin是唯一被批準用于食品工業的細菌素，其主要用于肉制品、乳制品、生鮮果蔬的保鮮?，F階段Nisin主要通過微生物發酵生產，然而野生型菌株Nisin的合成量遠不能滿足工業化生產需求。發酵工藝優化以及對關鍵功能基因進行過表達是促進乳酸鏈球菌合成Nisin的重要措施，但并沒有顯著提高Nisin的產量。近年來，合成生物學技術在提高目標產物產量上有著發酵工藝和代謝工程改造所無法具備的優點，也是研究者們不斷關注的熱點。多株乳酸鏈球菌全基因組測序數據的公布以及基于乳酸鏈球菌基因組規模代謝網絡模型的構建，使得研究人員能夠將乳酸鏈球菌作為一個整體來研究，從而獲得與Nisin生物合成密切相關的合成途徑與代謝調控網絡，為挖掘高效功能元件、確認合成途徑中關鍵功能基因和代謝途徑奠定重要基礎。多種基因組編輯技術的出現，如CRISPR/Cas9技術、Red/ET同源重組技術、Cre/loxP位點特異性重組技術等，可為乳酸鏈球菌進行合成生物學改造提供重要編輯工具，為促進乳酸鏈球菌Nisin的生物合成帶來全新的機遇。